P53蛋白表达与晚期卵巢浆液性腺癌预后的相关性

佐　晶，宋　艳，李　卓，吴令英

中国医学科学院　北京协和医学院　肿瘤医院　1妇瘤科　2病理科，北京 100021



·论著·

P53蛋白表达与晚期卵巢浆液性腺癌预后的相关性

佐晶1，宋艳2，李卓2，吴令英1

中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院1妇瘤科2病理科，北京 100021

摘要：目的探讨P53蛋白表达与晚期卵巢浆液性腺癌临床病理特征及预后的相关性。方法应用免疫组织化学方法检测183例晚期卵巢浆液性腺癌患者肿瘤组织中P53蛋白的表达，探讨其与患者临床病理特征及预后的关系。结果62.8%的患者组织中存在P53蛋白表达。P53蛋白的过度表达与卵巢浆液性腺癌二级分级和初始治疗前血清CA125的升高呈正相关(P<0.001，P=0.038)；单因素分析显示患者的预后与两级分级(P=0.007)、淋巴结转移(P=0.036)、术前CA125水平(P=0.002)及P53蛋白高表达(P<0.001)相关，多因素分析提示国际妇产科联盟分期(P=0.038)、淋巴结转移(P=0.002)及P53蛋白高表达(P=0.001)是独立的预后影响因素。结论P53蛋白的表达与晚期卵巢癌的预后密切相关，可作为预测卵巢癌预后的重要指标。

关键词：P53；卵巢浆液性腺癌；预后；免疫组织化学

ActaAcadMedSin，2016,38(2)：169-174

卵巢癌是目前致死率最高的妇科恶性肿瘤，2014年美国共有21 980例新发病例、14 270例死亡病例[1]，中国2011年的新发病例为83 851例[2]。由于发病隐匿、缺乏有效的早期诊断方法，约62%的患者就诊时已属于晚期[1]。晚期卵巢癌患者的标准治疗方案为手术及紫杉醇联合铂类的全身化疗，化疗耐药是导致卵巢癌复发和治疗失败的主要原因。国内外研究一直致力于早期预测卵巢癌的化疗耐药，从而进行个体化治疗，改善预后。p53基因是最早发现的抑癌基因之一，参与细胞周期的调控，识别并修复损伤DNA，对细胞分裂增殖起负性调节作用，p53基因突变是多种恶性肿瘤发生发展的重要环节。突变型p53基因目前已证实与乳腺癌、结肠癌、头颈部肿瘤、白血病等恶性肿瘤的不良预后密切相关[3]。本研究采用免疫组织化学方法回顾性分析183例晚期卵巢浆液性腺癌患者肿瘤组织中P53蛋白的表达情况，在蛋白水平研究p53基因与卵巢癌的临床病理特征及预后的关系，探讨P53蛋白在卵巢癌肿瘤评估及预后判断中的作用和意义。

对象和方法

对象选取中国医学科学院肿瘤医院2003年1月至2013年12月收治的晚期卵巢浆液性腺癌患者共183例。纳入标准：(1)手术病理诊断为原发性卵巢浆液性腺癌，手术病理分期为国际妇产科联盟(International Federation of Gynecology and Obstetrics，FIGO)Ⅲ～Ⅳ期；(2)初始治疗为卵巢癌肿瘤细胞减灭术，手术达到满意减瘤，残存肿瘤小于1 cm，术后接受6～8周期紫杉醇联合铂类的静脉化疗。排除标准：(1)术前曾接受过新辅助化疗或放疗者；(2)初次手术未达到满意减瘤者；(3)在本院实施手术后到外院进行化疗或因非疾病因素未完成规范治疗者；(4)临床资料不完整或治疗后失随者。

调查指标查阅病历，对入组患者疾病情况进行电话随访，获得临床资料，包括术前现病史、家族史、术前CA125、术中情况、术后病理、术后治疗情况及肿瘤复发后治疗情况等。

免疫组织化学方法检测P53蛋白表达每个病例均以4 μm/张厚度切取白片进行HE染色，确定组织学分级。冰冻切片免疫组织化学染色按照标准组织前处理方法进行 (Vectastain Elite ABC kit，Vector，Burlingame，CA)。组织去除包埋剂后，经10%中性福尔马林固定，按4 μm/张厚度切片，水化入磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffered saline，PBS)处理，并经0.3% H2O2室温浸泡30 min去除内生性过氧化物酶。PBS溶液洗涤后，进行2.5 g/ml的P53蛋白单克隆抗体(鼠抗人P53，DO- 7，invitrogen，CA)4℃过夜孵育(至少16 h)。PBS冲洗后，用生物素标记的马抗小鼠IgG 1∶200稀释，在1.5%马血清室温下封闭处理30～60 min。后用PBS冲洗，滴加亲和素-生物素-辣根过氧化物酶的大分子复合物室温孵育30 min。PBS冲洗后，以二氨基联苯胺室温显色。显色结束后，切片以苏木素复染细胞核，并脱水封片观察。本实验以不相关的小鼠抗体为阴性对照。

结果判定HE常规染色切片及免疫组织化学切片由两名病理科医生独立判定卵巢浆液性腺癌的分级，分级系统为Anais[4]于2004年提出的卵巢浆液性腺癌两级分级系统，并对免疫组织化学进行判定。阅片时病理科医生无从获取患者的临床信息。P53蛋白的阳性表达位于核膜，对核膜有棕色颗粒的细胞进行分析，根据强弱分为：阴性(-)，切片中阳性细胞数<25%；弱阳性(+)，切片中阳性细胞数25%～50%；中度阳性(++)，切片中阳性细胞数50%～75%，并少数呈强阳性；强阳性(+++)，切片中阳性细胞数>75%。生存期计算从手术日期到随访时获知的死亡日期。卵巢癌复发类型的判定：卵巢癌患者在满意肿瘤细胞减灭术后，接受紫杉醇联合铂类的化疗后已经获得完全缓解，停止化疗后6个月以内肿瘤复发者为铂类耐药型复发，停止化疗后6个月后肿瘤复发者为铂类敏感型复发，化疗过程中一直未达到完全缓解者为难治性卵巢癌。

统计学处理数据采用SPSS 18.0统计软件进行分析。应用卡方检验评估临床病理因素和p53表达之间的关系。使用Cox比例风险模型进行单因素及多因素预后分析，使用Kaplan-Meier方法测定生存曲线。P<0.05为差异有统计学意义。

结果

一般资料研究纳入的183例患者中，年龄低于50岁者占31.1%(57/183)，50岁以上者占68.9%(126/183)；肿瘤病理分级为低级别者占10.9%(20/183)，高级别者占89.1%(163/183)；29%(53/183)的患者曾有卵巢癌、乳腺癌等恶性肿瘤家族史；91.8%(168/183)患者为FIGO分期Ⅲ期，8.2%(15/183)患者为FIGO分期Ⅳ期；治疗前血清CA125水平<500 U/ml、500～1 000 U/ml、>1000 U/ml的患者分别占35%(64/183)、24%(44/183)、41%(75/183)，无复发、铂类敏感型复发、铂类耐药性型复发、难治性复发患者分别占25.1%(46/183)、51.9%(95/183)、17.5%(32/183)、5.5%(10/183)。

P53蛋白的表达对183例卵巢浆液性腺癌组织标本进行免疫组织化学染色，根据在卵巢癌细胞中不同程度的着色情况分为阴性(-)、弱阳性(+)、中度阳性(++)、强阳性(+++)(图1)。

P53蛋白的表达与临床病理因素的关系P53蛋白的表达与患者年龄及FIGO分期无关，但与初始治疗前血清CA125水平的高低呈正相关(P=0.038)，血清CA125水平越高的患者，P53蛋白表达为强阳性的比例越高。在高级别(低分化)肿瘤组织中，P53蛋白表达的阳性率为66.3%(108/163)，其中强阳性表达者占35%(57/163)，P53蛋白的表达强度与肿瘤的病理学分级显著相关(P<0.001)(表1)。

A～D.P53阴性(-)(A)、弱阳性(+)(B)、中度阳性(++)(C)、强阳性(+++)(D)；E～H.P53阴性(-)(E)、弱阳性(+)(F)、中度阳性(++)(G)、强阳性(+++)(H)免疫过氧化物酶染色(HE染色，×100)

A-D.P53-negative(-)(A)，P53-weak positive(+)(B)，P53-moderate positive(++)(C)，P53-strong positive(+++)(D)；E-H.P53-negative(-)(E)，P53-weak positive(+)(F)，P53-moderate positive(++)(G)，P53-strong positive(+++)(H) immunoperoxidase staining (hematoxylin eosin staining，×100)

图 1卵巢癌标本应用D0- 7单克隆抗体进行免疫组织化学染色结果

Fig 1Immunohistochemical staining of ovarian carcinoma specimens using DO- 7 monoclonal antibody

表 1　P53蛋白表达与临床病理因素的关系[n(%)]

FigO：国际妇产科联盟

FigO：International Federation of Gynecology and Obstetrics

P53蛋白的表达与肿瘤复发及生存期的关系铂类敏感型复发、铂类耐药型复发及难治性复发的患者生存期依次下降。其中P53蛋白强阳性表达的58例患者中，铂类耐药型复发及难治性复发占80.6%，P53蛋白的表达强度与肿瘤复发类型显著相关(P=0.002)，P53蛋白表达强度高的患者复发时间更短(表2)。多因素分析显示，P53蛋白的高表达与卵巢癌患者的总生存期显著相关(P<0.001)(表3)。P53蛋白表达强度为中度阳性(++)及强阳性(+++)的患者，预后较表达阴性(-)及弱阳性(+)的患者生存时间明显缩短(图2)。

讨论

p53基因是目前研究最多的抑癌基因之一，定位于人类染色体17p13.1，编码相对分子质量为53 000的核内磷酸化蛋白，称为P53蛋白。p53基因的突变及其后续产物涉及50%以上的肿瘤类型[5]。p53基因有多种突变方式，其中点突变引起的错义突变约占80%，在肿瘤发生过程中高频出现的点突变称为热点，在卵巢癌中报道的突变热点有 R273、R248、 R175、Y220[6- 7]。美国癌症基因谱计划对316例卵巢高级别浆液性癌患者进行测序，发现p53基因的突变率高达96%[8]。一些学者试图通过研究癌症基因谱的数据找到p53基因突变与患者生存及化疗耐药的关系[9- 12]，但由于缺乏p53突变的统一分类标准，各研究所得出的结果无法统一，无法明确p53突变对卵巢癌化疗耐药和预后的意义。

表 2　P53蛋白表达与肿瘤复发时间的关系[n(%)]

铂类敏感型复发：复发距离化疗停药时间>6个月；铂类耐药型复发：复发距离化疗停药时间<6个月；难治性复发：治疗过程中肿瘤进展

platinum-sensitive recurrence：the time from the completion of chemotherapy to the recurrence was more than 6 months；platinum-resistant recurrence：the time from the completion of chemotherapy to the recurrence was less than 6 months；refractory recurrence：the tumour progressed during the treatment

表 3　183例患者预后的Cox比例风险分析

图 2晚期卵巢浆液性腺癌患者Kaplan-Meier生存曲线

Fig 2Kaplan-Meier survival curves of patients with advanced serous ovarian carcinoma

卵巢浆液性癌是卵巢癌常见的组织学类型。随着临床病理学和分子遗传学研究的深入，卵巢浆液性癌的两级分级系统逐渐被广泛采纳。根据细胞核的异型性及核分裂指数将卵巢浆液性癌分为低级别浆液性癌和高级别浆液性癌。低级别浆液性癌核分裂象及p53基因突变罕见，常伴有K-ras、BRAF、ErbB2基因突变，肿瘤进展缓慢，预后较好；而高级别浆液性癌核分裂象丰富，80%以上伴有p53基因突变，且具有较大的异质性，可以发生在DNA结合结构域的每一个密码子上，肿瘤进展迅速[13- 14]。

本研究纳入183例晚期卵巢浆液性腺癌患者。经过复阅病理切片，低级别浆液性腺癌占10.9%，其P53阳性率为35%。而89.1%的患者为高级别卵巢浆液性腺癌，其P53阳性率为66.7%，不同病理学分级之间P53蛋白的表达有统计学意义(P<0.001)，与两级分级的分子遗传学特征一致。COX回归单因素分析提示病理学分级与预后显著相关(P=0.007)。

p53基因的错义突变导致突变型P53蛋白的稳定性增加，半衰期延长，可通过免疫组织化学方法检测，因此免疫组织化学方法(immunohistochemistry，IHC)成为应用最广泛的检测p53基因突变的方法。此外，p53基因突变还可以通过单链构象多态性分析或测序、荧光原位杂交、免疫测定等方法进行。IHC相对其他方法有简易、迅速、经济的优点，也是我国目前临床病理诊断中最常引用的检测手段。Kentaro等[15]分析21项IHC检测P53突变蛋白，结果显示无法完全明确P53蛋白与卵巢癌化疗反应之间的关系，主要原因为抗P53的单克隆抗体各异，并缺乏判读核染色的一致性标准。但应用DO- 7鼠抗人单克隆抗体检测P53蛋白可以准确区别阳性及阴性肿瘤，且不存在肿瘤内的异质性。Graeff 等[16]荟萃分析60项应用IHC方法检测p53突变状态，提示p53的突变状态与总生存期降低相关，其中应用DO- 7抗体的免疫组织化学研究及突变分析研究均提示明确的预后影响，p53突变是独立的预后危险因素。在妇科肿瘤学组(Gynecologic Oncology Group，GOG)的系列相关研究中，应用IHC方法检测P53蛋白的过度表达，使用的抗体为DO- 7鼠抗人单克隆抗体。GOG- 157研究中，P53蛋白的过度表达组较阴性组无进展生存期明显缩短；在GOG- 111研究中，P53蛋白过度表达与肿瘤分级相关[17]。本研究采用DO- 7单克隆抗体进行IHC检测，将细胞核染色情况分为4个等级。卡方检验、COX回归单因素及多因素分析提示p53的过度表达与晚期卵巢浆液性腺癌的预后相关，P53蛋白表达中度阳性(++)及强阳性(+++)与预后显著相关(P=0.005)，是独立的预后影响因素。

综上，本研究使用特异性较高的鼠抗人DO- 7单克隆抗体，应用免疫组织化学方法检测晚期卵巢浆液性腺癌组织中P53蛋白的表达情况，明确了P53蛋白表达与肿瘤预后及化疗敏感性的关系，为进一步探索卵巢癌耐药预测标记物提供了依据。目前针对p53突变的深入研究仍在继续，利用热休克蛋白90能够促进p53形成稳定突变而进行的针对性靶向治疗研究正在进行当中，相信未来p53突变相关的检测和应用将有更加广阔的前景。

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Relationship between P53 Protein Expression and Prognosis of Advanced Ovarian Serous Adenocarcinoma

ZUO Jing1，SONG Yan2，LI Zhuo2，WU Ling-ying1

1Department of Gynecologic Oncology，2Department of Pathology，Cancer Institute & Hospital，CAMS and PUMC，Beijing 100021，China

ABSTRACT：ObjectiveTo study the expression of P53 protein in the advanced ovarian serous adenocarcinoma and explore its potential correlation with the clinicopathological features and prognosis of ovarian cancer. MethodsThe immunohistochemical staining was used to detect the expression of P53 protein in 183 patients with advanced ovarian serous adenocarcinoma. The correlation of P53 protein with the clinicopathological features and its significance in the assessment of prognosis were explored. ResultsThe P53 protein expression was positive in 62.8% of the patients. Chi-square test showed that the overexpression of P53 protein was positively correlated with the elevation of serum CA125 and the two-tier grading of ovarian serous adenocarcinoma (P<0.001，P=0.038). Univariate analysis suggested that the prognosis of patients was associated with two-tier grading (P=0.007)，lymph node metastasis (P=0.036)，preoperative serum CA125 level (P=0.002)，and P53 overexpression (P<0.001). Multivariate analysis showed that the International Federation of Gynecology and Obstetrics stage (P=0.038)，lymph node metastasis (P=0.002)，and overexpression of P53 (P=0.001) were independent prognostic factors. ConclusionThe P53 protein expression is closely related to the prognosis of advanced ovarian serous adenocarcinoma and can be used as an important indicator for predicting the prognosis.

Key words：P53；ovarian serous adenocarcinoma；prognosis；immunohistochemistry

(收稿日期：2016- 02- 10)

Corresponding author：WU Ling-yingTel/Fax：010- 87788996，E-mail：wulingying@csco.org.cn

DOI：10.3881/j.issn.1000- 503X.2016.02.008

中图分类号:R737.31

文献标志码:A

文章编号：1000- 503X(2016)02- 0169- 06

通信作者：吴令英电话/传真：010- 87788996，电子邮件：wulingying@csco.org.cn