三阴性裸鼠乳腺癌模型的构建及热层析检测

霍慧萍，霍建彬，万文博，李俊来

1中国人民解放军总医院南楼超声诊断科，北京 100853

2内蒙古巴彦淖尔市临河区人民医院保健科，内蒙古巴彦淖尔 015000



·论著·

三阴性裸鼠乳腺癌模型的构建及热层析检测

霍慧萍1，霍建彬2，万文博1，李俊来1

1中国人民解放军总医院南楼超声诊断科，北京 100853

2内蒙古巴彦淖尔市临河区人民医院保健科，内蒙古巴彦淖尔 015000

摘要：目的利用标记了荧光素酶和绿色荧光蛋白的人乳腺癌MDA-MB- 231细胞系建立乳腺癌裸鼠移植瘤模型，用热层析成像仪联合超声对早期微小肿瘤进行检测。方法采用转染了慢病毒载体的人三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB- 231，经传代培养后接种于BALB/C裸鼠的左肩胛部皮下、右侧第4对乳房垫下及尾静脉注射，利用热层析成像仪和超声仪在肿瘤生长早期进行检测，并用小动物活体成像仪监测肿瘤细胞在裸鼠体内的生长情况。结果成功构建了三阴性乳腺癌裸鼠皮下、原位移植瘤及转移癌模型。利用热层析成像仪和超声仪同时检测微小肿瘤，热层析成像仪对微小肿瘤的检出要早于超声检出。结论热层析成像仪可以较早期地监测到肿瘤的生长变化，探测到异常组织，有望为人类早期乳腺癌的筛查提供一个方便、快捷、灵敏和可靠的检查手段。

关键词：三阴性乳腺癌；动物模型；热层析成像仪系统；小动物活体成像系统

ActaAcadMedSin，2016,38(2)：198-204

三阴性乳腺癌(triple negative breast cancer，TNBC)是指雌激素受体、孕激素受体和人原癌基因Her- 2均阴性表达的乳腺癌[1- 3]。虽然TNBC的发病率不及其他亚型乳腺癌，但因其侵袭性较强、远处转移风险较高、临床预后极差、死亡风险较高，故而引起肿瘤学家们的广泛关注[1，4- 5]。尽可能在早期发现并积极治疗是改善预后、提高生存率的关键[6- 7]。为研究乳腺癌发生发展早期的生物学特性，探讨其诊断及治疗的有效措施，建立仿真活体动物模型有重要的意义[8]。因此，在裸鼠体内建立早期人TNBC动物模型，可以深入研究TNBC细胞系在动物体内的发展过程及生物学行为，符合人体肿瘤特征，具有良好的可重复性，为研究该疾病早期检测和治疗提供理论依据[9- 10]。热层析成像技术是近年影像医学发展起来的一项新技术，通过探测生物体内部热分布信息来灵敏的感知疾病在体内的发生发展过程，从而提供疾病诊断线索和鉴别诊断依据[11- 12]。热层析成像技术将形态影像学和功能影像学信息集成于一体，提供尽可能多的影像学信息用于医学分析和研究[13- 17]。本研究利用热层析成像技术对成瘤裸鼠进行早期检测，观察乳腺癌发生早期的生长状况，探讨乳腺癌细胞在生物体内的生长趋势及其特征，并与目前我国常用的超声筛查手段进行比较，以期发现更小、更早期的乳腺癌病变，从而为TNBC的早期检测提供可靠、灵敏、便捷的新的检查方式。

材料和方法

材料转染了慢病毒载体的人三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB- 231(标记为MDA-MB- 231-GFP-luc)购自中国人民解放军总医院肿瘤中心实验室。BALB/C裸鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司(No.11400700097297)，实验动物伦理申请批号 2015-X10- 24。选用雌性，无特定病原体级实验动物17只，4～6周龄，体质量16～20 g，饲养于中国人民解放军总医院层流无菌国标免疫缺陷动物房。DMEM、1640培养液、PBS缓冲液、青霉素、链霉素及胎牛血清购自Gibco (China)公司；荧光素酶底物购自北京冷泉港生物科技有限公司。中国武汉昊博科技有限公司自主研发的热层析成像仪(HB-T- 2A型，探测器的光谱响应波长范围：8～14 μm，测温范围：20℃～40℃)；超声仪(PHILIPS，CX50，Epiq 7，西雅图，美国)，倒置荧光显微镜(Ocean Optics Corporation，USA)、小动物活体成像仪(Xenogen IVIS200 imaging spectrum system，USA)。

细胞复苏、培养及传代严格遵守无菌操作。遵从“速溶慢冻”的实验原则，将冻存的MDA-MB- 231-GFP-luc细胞按照操作规程逐步提取、离心、培养。将传代2次的MDA-MB- 231-GFP-luc细胞在其对数生长期细胞用计数器计数，得到细胞浓度为5×107个/ml 的细胞悬液共2.5 ml，经锥虫蓝染色测定活细胞数>95%。

动物接种将裸鼠分为4组，随机选取2只为对照组，不做任何处理，另外15只随机分为3组，每组各5只，1组为皮下瘤模型组，于右侧肩胛近腋窝处皮下接种MDA-MB- 231-GFP-luc细胞悬液，150 μl/只；2组为原位瘤模型组，于右侧第四对乳房垫下接种细胞悬液，150 μl/只。3组为转移瘤模型组，尾静脉注射细胞悬液，150 μl/只。每组小鼠分笼饲养，专用鼠粮紫外线消毒处理，饮用去离子纯净水。4组小鼠分别用不同颜色涂料在其耳朵上标记并打耳标加以区分。

热层析、超声及小动物活体成像仪检测为关注乳腺癌发生初期的肿瘤代谢特征，在注射癌细胞的次日起每天进行监测，采用武汉昊博公司生产的近红外热层析成像仪、超声仪及小动物活体成像仪监测癌细胞在裸鼠体内的存活状态。每只裸鼠腹腔注射20 mg/ml的荧光素酶底物荧光素酶报告基因150 μl，10～15 min内用美国小动物活体荧光成像仪活体成像系统(IVIS200)进行活体成像，随后分别进行热层析和超声检查。接种第2天起每天监测裸鼠的各项体征及接种部位的变化，于第5天起，实验组皮下及原位瘤模型组小鼠肉眼观察到其接种部位外观略有变化，并用手感觉到有小颗粒状硬结，对照组及转移瘤模型组无变化。此时用热层析检测可见肿瘤部位有异常表现，随后用超声检查，未见异常发现。

结果

BALB/C裸鼠皮下瘤模型的建立MDA-MB- 231-GFP-luc细胞悬液150 μl接种到裸鼠右侧肩胛近腋窝处，观察至第7天时肉眼可见局部微微隆起的小肿物，用手轻触感觉到有小颗粒状硬结，活动度差。腹腔内注射20 mg/ml的荧光素酶底物150 μl，注射10～15 min内用IVIS200进行活体成像，肿瘤部位已有较强的荧光信号，肿瘤部位荧光图像可见彩虹样荧光标志。待实验全程结束观察完毕后处死裸鼠，取病理标本做HE染色，显示细胞核异型，浓染，细胞排列紊乱，可见癌株及癌巢(图1)。

BALB/C裸鼠原位瘤模型的建立采用与皮下瘤模型同样的方法接种裸鼠右侧第4对乳头下方乳垫区，观察至第5天时肉眼可见局部微微隆起的小肿物，用手轻触感觉到有小颗粒状硬结，活动度差。小动物活体荧光成像可见肿瘤部位呈彩虹样荧光标志。待实验完毕后取病理标本HE染色示细胞核异型，浓染，细胞排列紊乱(图2)。

A.皮下荷瘤裸鼠模型白光图；B. 荧光素酶报告基因与转染了慢病毒的乳腺癌细胞MDA-MB- 231-GFP-luc反应后的活体生物荧光成像图；C.裸鼠乳腺癌病理HE染色(×40)

A. photo of a subcutaneous tumor-bearing nude mouse model；B.invivoimaging system fluorescence imaging of luciferase substrate reacted with transfection of the slow virus breast cancer cells MDA-MB- 231-GFP-luc；C. pathological HE staining of breast cancer in nude mice(×40)

图 1皮下荷瘤裸鼠模型

Fig 1Subcutaneous tumor-bearing nude mouse model

A. 原位荷瘤裸鼠模型白光图；B. 荧光素酶报告基因与转染了慢病毒的乳腺癌细胞MDA-MB- 231-GFP-luc反应后的活体生物荧光成像图；C.裸鼠乳腺癌病理HE染色(×40)

A. photo of the orthotopic tumor-bearing nude mouse model；B.invivoimaging system fluorescence imaging of luciferase substrate reacted with transfection of the slow virus breast cancer cells MDA-MB- 231-GFP-luc；C. pathological HE staining of breast cancer in nude mice(×40)

图 2原位荷瘤裸鼠模型

Fig 2Orthotopic tumor-bearing nude mouse model

BALB/C裸鼠转移癌模型的建立MDA-MB- 231-GFP-luc细胞悬液150 μl于裸鼠尾静脉缓慢注射。小动物活体成像仪连续观察肿瘤细胞在裸鼠体内的转移种植情况，用手触及始终未摸到腹腔肿物，用热层析及超声也未能检测到异常信号，于第10天时，小动物活体荧光成像仪于腹腔内发现多处荧光信号，在荧光信号引导下剖腹探查区病理组织，同时取周围未见荧光信号的组织做HE染色，病理切片可见荧光信号处细胞排列紊乱，核异型，可见核沟，核浓染(图3)。

热层析检测及超声检测结果在乳腺癌细胞接种后每天进行热层析及超声检测，同时用小动物活体荧光成像仪观察肿瘤细胞是否在裸鼠体内存活生长。于第5天起，热层析在裸鼠皮下及原位模型中可检测到异常热图，肿瘤部位明显异常于正常组织部位，同时用超声设备尚不能够很好地显示肿瘤结节。此时用电子游标卡尺测量肿瘤平均直径仅为2.8 mm。热层析显像虽然可以显示出肿瘤部位与周围正常组织有所差异，但是未能如理论推测显示为高温区，即肿瘤部位较周围正常组织温度升高，而是显示为低温区。在给裸鼠进行热层析监测时为了不影响其基础体温及病变部位的原始温度，特意未给裸鼠运用任何气、液麻药。连续观察至第9天时，热层当肿瘤直径达5 mm以上时超声方可探及异常声像图(图4)。

病理检测结果当连续观察完肿瘤早期发生发展情况后，对每一只裸鼠进行断颈处死，取组织病理标本进行HE染色。对腹腔转移瘤标本进行剖腹探查，在荧光显像处及正常部位均取组织标本做病理染色。病理切片可见荧光信号处细胞排列紊乱、密集，核异型，可见核沟，核浓染(图5)。

A.裸鼠腹腔转移癌模型白光图；B.荧光素酶报告基因与转染了慢病毒的乳腺癌细胞MDA-MB- 231-GFP-luc反应后的活体生物荧光成像图；C.裸鼠乳腺癌腹腔转移灶病理HE染色(×40)A. photo of the peritoneal metastasis model of nude mice；B. luciferase reporter gene and transfection of the slow virus breast cancer cells MDA-MB- 231-GFP-luc after reactioninvivobiological fluorescence imaging；C. pathological HE staining of peritoneal metastasis of breast cancer in nude mice(×40)

图 3裸鼠腹腔转移癌模型

Fig 3Peritoneal metastasis model of nude mice

上图：接种癌细胞后连续观察至第5天热层析可见异常表现；下图：超声连续观察至第9天可见异常声像图(箭头)

up：after inoculation of cancer cells for fifth consecutive days，thermal tomography showed abnormal performance；down：ninth days of ultrasound can detect abnormal sonographic image (arrow)

图 4肿瘤生长早期的热层析及超声表现

Fig 4Thermal tomography and ultrasound findings in early stage of cancer

A.同一只裸鼠的皮下瘤模型；B.热层析成像图；C.HE病理染色乳腺癌细胞浸润(×40)A. the same nude mouse subcutaneous tumor model；B. thermal tomography；C. pathological staining of breast cancer cells by HE staining (×40)

图 5荷瘤裸鼠的热层析对照及病理验证

Fig 5Thermal tomography and pathology of tumor bearing nude mice

讨论

乳腺癌动物模型的建立为研究人类乳腺癌的预防、发生、诊断及治疗发挥重要的作用[18- 19]。本研究在实验组皮下及原位模型成功率较高，达到100%，而转移瘤模型成功率较低，一方面是由于BALB/C裸鼠缺少胸腺，为T细胞免疫缺陷动物，体液免疫降低但并不完全丧失，而尾静脉内注射癌细胞后由于存在部分体液免疫，部分癌细胞被体液免疫所破坏，所以成瘤率略低；另一方面，癌细胞数目也是决定成瘤率的重要因素，细胞浓度过高会造成血管或心脏栓塞，造成小鼠死亡。科研工作者必须掌握各种模型的建模要点，根据实验设计及研究终点选择适当的模型[20- 22]，优化动物模型的制作思路[23- 24]，从而研制出更能真实客观模拟人类癌症特点的模型，使其与人类肿瘤的生物学、组织学特性越来越接近，乳腺癌的动物模型才会更具科学价值[25- 27]。

热层析图在肿瘤生长早期即可探测到其变化[28]，可以较早期地显示出肿瘤部位与周围正常组织的差异，而且较临床中常用的超声筛查乳腺病变方法灵敏度提高，因此有进一步的研究和探索价值。本研究对同一种动物模型进行双模态检测，比较哪种检测手段更能够接近事实，以最终的病理和动态的小动物活体成像仪验证其可靠性。为更好地模拟人类乳腺癌细胞在活体内的生物学行为，本研究选用缺少胸腺的部分性免疫缺陷裸鼠作为活体载体，该裸鼠不具有T细胞免疫功能，但具有略微降低了的体液免疫功能，同时选用人类三阴性乳腺癌细胞，以期让该细胞在活体内生长扩增，展示其特异性的侵袭性生物学行为，虽然不能够完全模拟人类乳腺癌细胞在具有正常免疫功能的人体内的生长状况，但只能是尽可能的接近活体模拟状态。在癌细胞悬液接种到裸鼠体内后，前3 d活细胞量由于生长环境改变、培养基缺失、营养不足等因素大部分会死掉，3 d以后有细小的毛细血管开始爬入进行营养供应，使得部分存活细胞得以继续生长繁殖[29]。在细胞扩增的过程中，给予连续性的监测，一种手段是临床中常用的超声设备，另一种手段是新开发研制的高灵敏度热层析检测仪，对比哪种方法能更早期地捕捉到肿瘤的生长变化，研究结果显示，热层析系统可以在细胞接种第5天，即经过活细胞量骤减的前3天后，存留活细胞在生物体内得到新的血液供应的第2天开始就可以观察到不同于周围正常组织的细微变化，而在继续连续监测到第9天时，热层析的肿瘤图像持续变大，超声图像才可以观察到肿瘤形态结构显像。因此，热层析系统在肿瘤的早期检测方面优于超声。本研究未能显示肿瘤部位为高温区，即肿瘤部位较周围正常组织温度升高，而是显示为低温区，究其原因，可能由于裸鼠皮肤较薄，体表无保温层，皮下无脂肪组织，肿瘤种植于皮下后突出皮肤较明显，恶性肿瘤的温度散失较明显；加之超净台中风机影响，肿瘤区温度未能完全模拟人乳腺癌的本质，造成肿瘤区温度较低。

综上，本研究采用小动物活体荧光成像仪进行协助建模，较之前常用的实验动物方法，即在每一个时间点对其进行处死取材进行病理验证有了极大改善，可以连续对同一只裸鼠进行动态监测，这样更加合理、客观、真实地反映肿瘤细胞的动态发生发展过程。热层析系统可以在细胞接种后连续观察至第5天开始就可以观察到不同于周围正常组织的细微变化，继续监测至第9天时，热层析图像的肿瘤持续变大，此时超声图像才可以观察到肿瘤形态结构显像。因此，热层析系统在肿瘤的早期检测方面优于超声。在接下来的实验中，将进一步探讨更能模拟人乳腺癌细胞在较厚的皮下脂肪层内的发生发展过程，力求制作出仿真动物模型，将新型热层析成像系统的科学作用发挥出来，为人类乳腺癌的相关研究提供更加可靠、方便、快捷、灵敏的诊疗手段。

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Construction of Nude Mouse Model of Triple Negative Breast Cancer and Value of Thermal Tomography

HUO Hui-ping1，HUO Jian-bin2，WAN Wen-bo1，LI Jun-lai1

1Department of South Building Ultrasound，Chinese PLA General Hospital，Beijing 100853，China2Department of Health，Inner Mongolia Bayinnaoer City Linhe People’s Hospital，Bayannur，Inner Mongolia 015000，China

ABSTRACT：ObjectiveTo explore the early detection of breast cancer by ultrasonic imaging and thermal tomography of luciferase or green fluorescent protein (GFP)-labeled MDA-MB- 231 breast cancer cell line-xenografts in nude mice. MethodsFluorescence-tagged lentiviral vectors were transfected into the triple-negative breast cancer cell line MDA-MB- 231. These cells were implanted either subcutaneously under the right breast pad or intravenously into the tail vein of nude BALB/C mice. Thermal tomography and ultrasound imaging were used to detect tumor formation and to monitor tumor growth and metastasis in vivo.ResultsTriple negative breast cancer cell line-xenografts were used to successfully construct an orthotopic nude mice model of breast cancer metastasis in the peritoneum. Thermal tomography and ultrasound imaging were used together to detect small tumors. Thermal tomography imaging detected small tumors earlier than ultrasound imaging. ConclusionsThermal tomography can be used to monitor changes in tumor growth and detect abnormal tissue. Therefore，it can serve as a convenient，rapid，sensitive，and reliable technique for early screening of human breast cancer.

Key words：triple negative breast cancer；animal model；thermal tomography imaging system；in vivo imaging spectrum system

(收稿日期：2015- 12- 11)

Corresponding author：LI Jun-laiTel：010- 66876050，E-mail：li_jl@yeah.net

DOI：10.3881/j.issn.1000- 503X.2016.02.013

中图分类号:R445.1

文献标志码:A

文章编号：1000- 503X(2016)02- 0198- 07

通信作者：李俊来电话：010- 66876050，电子邮件：li_jl@yeah.net

基金项目：科技部国家重大科学仪器设备开发专项(2012YQ1020304)Supported by the National Major Scientific Equipment Development Program (2012YQ1020304)