解毒消癥饮治疗胃癌机制的计算机筛选研究

王　君，杨雪梅，陈梅妹，陈立武

(1.福建中医药大学附属第二人民医院普外科，福建 福州　350003；2.福建中医药大学中医学院，福建 福州　350122)



解毒消癥饮治疗胃癌机制的计算机筛选研究

王君1，杨雪梅2，陈梅妹2，陈立武1

(1.福建中医药大学附属第二人民医院普外科，福建 福州350003；2.福建中医药大学中医学院，福建 福州350122)

[摘要]目的采用计算机虚拟筛选技术探讨解毒消癥饮治疗胃癌的作用机制。方法先采用分子描述符计算和主成分分析法研究解毒消癥饮中148个化合物与32个抗肿瘤药物的化学空间信息分布，探讨其类药性质；再通过分子对接方法研究解毒消癥饮和肿瘤相关受体靶标如人表皮生长因子受体家族(epidermal growth factor receptor，EGFR；human epidermal growth factor receptor-2，HER-2)和环氧化酶-2(cyclooxygenase-2, COX-2)的相互作用情况，以探讨其治疗胃癌的分子机制。结果解毒消癥饮所含分子与抗肿瘤药物有类药性，且更具多样性；解毒消癥饮中91个化合物与EGFR、HER-2和COX-2有着显著的活性抑制作用。结论解毒消癥饮治疗胃癌的作用机制可能涉及到抑制肿瘤细胞增殖、侵袭转移及促细胞凋亡等方面，与胃癌发病机制相符合。

[关键词]解毒消癥饮；胃癌；分子描述符；分子对接

胃癌是最常见的恶性肿瘤之一。近年来，胃癌的发病率和病死率已显著下降[1]，但仍旧是全球第四大常见肿瘤，居肿瘤相关死亡病因的第二位[2]。中国是胃癌的高发区，年患病率和病死率居高不下，均是世界平均水平的2倍多[3]。人表皮生长因子受体家族(epidermal growth factor receptor，EGFR；human epidermal growth factor receptor-2，HER-2)和环氧化酶-2(cyclooxygenase-2, COX-2)被认为与人类肿瘤密切相关，是胃癌靶向治疗的不同靶点基因。

EGFR和HER-2都属于Ⅰ型酪氨酸激酶受体基因家族，受体的蛋白结构由细胞外配体结合区、跨膜区及胞内酪氨酸激酶区组成[4]。EGFR与配体结合后引起受体二聚化及胞浆内酪氨酸激酶区自身磷酸化并激活酪氨酸激酶的活性，进而激活下游的信号通路，如膜受体酪氨酸蛋白激酶信号传递途径(retrovirus-associated DNA sequences-rapidly accelerated fibrosarcoma-mitogen activated protein kinase，Ras-Raf-MAPK)、酪氨酸激酶-信号转导子和转录活化因子(janus kinase-signal transducer and activator of transcription，JAK-STAT)、磷酯酰肌醇-3激酶-丝氨酸/苏氨酸激酶(phosphatidyli nositol 3-kinase-serine/threonine kinase，PI3K-Akt)等，参与肿瘤细胞增殖、血管生成、侵袭、转移及凋亡抑制等基因调控，在多种肿瘤组织中有高表达。EGFR在进展期胃癌中高度表达，常伴有EGFR相关蛋白的表达下调，提示患者预后很差[5]。HER-2与EGFR结构相似，有很高的同源序列。在正常情况下处于非激活状态，当受到体内外某些因素作用后，其结构或表达调控失常从而被激活，具有肿瘤转化活性，最终从多个途径影响肿瘤细胞的生物活动，如细胞增殖、黏附、转移和分化等，导致肿瘤的复发和转移[6]。在人类许多上皮源性肿瘤如乳腺癌、卵巢癌、肺癌、胃癌中发现存在有HER-2癌基因的扩增及其癌基因蛋白的过表达，而且HER-2亦参与肿瘤的形成。HER-2在NCI-N87和4-1ST等胃癌细胞系中常高表达。HER-2过度表达的恶性肿瘤具有更强的侵袭、转移能力，预后较差[4,7]。

COX是花生四烯酸代谢的关键限速酶，目前已发现至少有COX-1和COX-2两种亚型。近年来,大量研究结果表明,COX-2过度表达与消化系统肿瘤的发生和发展密切相关[8-9]。COX-2的高表达能够促进细胞黏附，抑制细胞凋亡、促进肿瘤生长加速和侵袭转移，预后变差[10]。

中医药在胃癌的治疗中发挥着独特作用，目前许多研究证实中西医结合治疗胃癌可以取长补短，提高远期疗效。解毒消癥饮是福建中医药大学附属第二人民医院用于消化系统肿瘤围手术期治疗的临床验方,主要由白花蛇舌草、苦参、夏枯草和山慈姑四味中药组成(根据最新临床研究结果，去掉原方中鬼针草，新增夏枯草)，该方被临床证明具有减少复发、延长患者生存期、提高患者生活质量的功效[11]。考虑到复方制剂成分复杂，抑制肿瘤生长的途径是多方面的，各种具体有效成分尚未明确，本研究将通过计算机药物虚拟筛选技术中分子对接方法来探讨解毒消癥饮治疗胃癌的作用机制，为指导临床用药奠定分子生物学基础。

1材料与方法

1.1分子化合物的收集和结构优化根据解毒消癥饮中药组成从《Beilstein/Gmelin CrossFire化学数据库》《北京大学中草药数据库》《中华本草》《中药原植物化学成分手册》等国内外文献收集中药化学成分，经过分子结构校对和排重，得到复方所含化合物148个。在分子计算软件Discovery Studio 2.0(DS 2.0)的Standalone模块搭建分子结构，并用Ligand Minimization模块，选用默克分子力场(merck molecular force field，MMFF)进行分子三维结构优化。软件运行环境为DS 2.0图形工作站，Microsoft Windows XP Professional SP2操作系统。

此外，根据当前抗肿瘤药物类型收集32个抗肿瘤药物，主要涉及烷化剂、抗代谢物、抗肿瘤抗生素、铂类配合物和激素大类，用于分析解毒消癥饮中化合物的抗肿瘤类药性，并按上述方法进行三维结构优化。

1.2分子描述符的计算分子描述符是连接分子结构和化合物活性的纽带，是表征化学结构变化的参数，可以揭示分子的空间信息[12]。因此，本研究选取了19个比较常用的分子描述符进行计算，其中结构描述符包括分子量(molecular weight，MW)、可旋转化学键数(rotational chemical bond number，nRB)、环个数(ring number，nR)、芳环个数(aromatic ring number，nAR)、氢键受体数(hydrogen bond receptor number，nHAcc)、氢键给体数(hydrogen bond donor number，nHDon)，空间描述符包括分子体积(molecular volume，Vm)、分子表面面积(molecular surface area，SA)、极性表面面积(polar surface area，PSA)、极性表面积分率(fractional polar surface area，FPSA)，拓扑描述符包括Wiener指标、Zagreb指标、Kappa形状指标(6个)，脂水分配系数为AlogP98[13]。为了从多维数据中提取直观的信息，本研究运用SPSS 19.0对所计算的19个描述符进行了主成分分析。

1.3分子对接

1.3.1受体晶体结构处理从国际蛋白晶体结构数据库下载EGFR受体、HER-2受体和COX-2酶的三维结构，代码分别为3W32、3RCD和3LN1。分子对接前需要进行一定处理，即载入charm力场，在此力场下拟合受体大分子的键缩能、键角弯折能、二面角扭转能、范德华相互作用能、静电相互作用能等经验参数，然后去除水分子环境，加上极性氢原子并赋予电荷。

1.3.2分子对接计算分子对接采用DS 2.0中的LigandFit模块，以蛋白质的原配体分子所在位置为结合位点，半径为0.5 nm内的所有氨基残基作为结合位点的活性口袋。计算蛋白配体相互作用能，采用Dreiding力场打分，柔性对接，使用蒙特卡罗方法进行构象采样，采样步长为15 000步，只保留得分最高构象。其余参数使用LigandFit中的缺省值。

1.3.3对接结果评价LigandFit默认采用LigScore1、LigScore2、PLP1、PLP2等打分函数来综合评价分子之间相互作用的几何形状匹配、能量匹配及化学环境匹配。Dockscore是对接结果的衡量指标，因此，以原配体的Dockscore值及实验值为标准，筛选复方有效抑制成分。

1.3.4运行软件应用Accelrys公司的DS 2.0软件。软件运行环境：DS 2.0 图形工作站，Microsoft Windows XP Professional SP2操作系统。本研究在北京大学中药现代化研究中心计算机模拟实验室完成。

2结果

2.1解毒消癥饮中分子化合物的化学空间信息分析解毒消癥饮中化合物常用分子描述符的统计值见表1，其中，MW、nHDon、nHAcc和ALogP98的平均值和中位数均符合口服药的五大规则[10]，即MW小于500，nHDon小于5，nHAcc小于10，ALogP98小于5。因此，解毒消癥饮中大部分化合物具有较好的类药性质。图1为解毒消癥饮中化合物与抗肿瘤药物的主成分分析示意图，3个主成分PC1、PC2和PC3，基本包含了全部指标具有的信息，累计贡献率分别达到96%和83%，特征值都大于1。解毒消癥饮中化合物在图中分布较广，说明其含有的化合物结构具有多样性，体现了中药复方化学成分多样性。另外，图1中解毒消癥饮中化合物与抗肿瘤药物在化学空间分布有较大的重叠，说明二者化合物结构具有较大的相似性，又保持各自的特点。

2.2解毒消癥饮中化合物与靶标相互作用分析根据靶标晶体复合物中配体与靶标蛋白Dockscore值大小，以100为解毒消癥饮中抗肿瘤显著活性成分的阈值，共筛选出91个显著活性化合物，约占复方化合物总数的70%(见表2)。这些活性成分主要来自苦参、白花蛇舌草和夏枯草3味中药。表2中靶标名称显示，苦参、白花蛇舌草分别含有能与3个靶标(EGFR，HER-2和COX-2)有显著活性作用的化合物，而夏枯草含有与EGFR和HER-2有显著活性作用化合物，说明3味中药之间相互协同以增强药效。从活性化合物个数可以得出，苦参是复方中含有活性成分最多的中药，说明苦参在该复方中的重要位置。表2的靶标功能显示，解毒消癥饮的作用机制可能涉及到抑制肿瘤细胞增殖、侵袭转移及促细胞凋亡等方面。其中，抑制肿瘤细胞增殖、侵袭转移作用主要是通过抑制EGFR和HER-2来调控肿瘤细胞分化进程。抑制肿瘤细胞增殖、促细胞凋亡作用主要是通过抑制COX-2来调控肿瘤细胞的代谢。

表1　解毒消癥饮中化合物常用分子描述符的

注：绿色方形表示解毒消癥饮中化合物，红色圆形表示抗肿瘤药物。

图1解毒消癥饮中化合物与抗肿瘤药物的

主成分分析示意图

3讨论

解毒消癥饮中化合物分子描述符的统计值，表明解毒消癥饮中大部分化合物具有较好的口服吸收类药性质。解毒消癥饮中化合物与抗肿瘤药物的主成分分析示意图表明解毒消癥饮不仅含有抗肿瘤活性化合物，同时还含有其他生理活性的化合物。解毒消癥饮虚拟筛选结果显示，91个显著活性化合物主要来自苦参、白花蛇舌草和夏枯草3味中药。苦参是临床上常用的抗癌解毒中药，具有抑制肿瘤细胞生长，保护机体免疫等作用。白花蛇舌草具有抗肿瘤、抗化学诱变、抗氧化、抗菌及免疫调节作用，临床主要用于治疗肿瘤和炎性反应疾病。夏枯草具有直接抑制肿瘤生长与增殖作用，诱导肿瘤细胞凋亡，调节机体免疫等作用，是一种常用抗肿瘤中药。可见，分子对接计算结果与3味中药的药效基本一致。解毒消癥饮与EGFR，HER-2和COX-2都有相互作用，体现了中药多靶点、多种途径、多层次地作用于肿瘤细胞。同时，通过对解毒消癥饮相互作用的靶标(EGFR，HER-2和COX-2)功能分析，可以推测解毒消癥饮抗肿瘤作用是通过多种机制协同抑制肿瘤细胞增殖、侵袭转移及促细胞凋亡作用而实现的，这与恶性肿瘤的发病机制相一致。

表2　解毒消癥饮靶标的虚拟筛选结果

结果表明，解毒消癥饮是通过抑制EGFR，HER-2和COX-2多靶标协同抑制肿瘤细胞增殖、侵袭转移及促细胞凋亡作用而实现抗肿瘤作用，证实胃癌与EGFR，HER-2和COX-2密切关系，同时也揭示白花蛇舌草、苦参和夏枯草3味中药在复方中抗肿瘤的重要作用，可有效地防止肿瘤的生长和转移。

(衷心感谢北京大学徐筱杰教授课题组提供的技术支持与帮助！)

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A Computer-based Virtual Screening Study of Therapeutic Mechanism of Jiedu Xiaozheng Decoction in Treatment of Gastric Cancer

WANGJun1,YANGXue-mei2,CHENMei-mei2,CHENLi-wu1

(1.TheSecondPeople’sHospitalAffiliatedtoFujianUniversityofTraditionalChineseMedicine,FujianFuzhou350003,China; 2.CollegeofTraditionalChineseMedicine,FujianUniversityofTraditionalChineseMedicine,FujianFuzhou350122,China)

[Abstract]Objective To explore the therapeutic mechanism of Jiedu Xiaozheng Decoction (JDXZD) in the treatment of gastric cancer using the computer-based virtual screening method. MethodsThe calculation of molecular descriptors and analysis of principal components were used to study the distribution of information on 148 compounds in JDXZD and 32 anticancer drugs in chemical space, and to evaluate the drug-likeness of the compounds in JDXZD. Molecular docking was used to study the interactions between the compounds in JDXZD and tumor-related receptors such as epidermal growth factor receptor (EGFR), human epidermal growth factor receptor-2 (HER-2), and cyclooxygenase-2 (COX-2), and to explore the molecular mechanism of JDXZD in the treatment of gastric cancer. ResultsThe compounds in JDXZD resembled the anticancer drugs and had a higher diversity than the anticancer drugs. Ninety-one compounds in JDXZD exhibited substantial inhibitory effects on EGFR, HER-2, and COX-2. ConclusionThe therapeutic mechanism of JDXZD in the treatment of gastric cancer might be associated with inhibition of proliferation, invasion, and metastasis of tumor cells and promotion of apoptosis, which is in accord with the pathogenesis of gastric cancer.

[Key words]Jiedu Xiaozheng Decoction; Gastric cancer; Molecular descriptor; Molecular docking

(收稿日期：2015-09-06；编辑：姚实林)

[中图分类号]R735.2；R285.5

[文献标志码]A[DOI]10.3969/j.issn.2095-7246.2016.02.021

通信作者：陈立武，945162540@qq.com

作者简介：王君(1976-)，男，硕士，主治医师

基金项目：福建省中医药科技项目(wzrk201303)；国家自然科学基金项目(81202646，81503497)；福建省自然科学基金面上项目(2015J01340)