苦参黄酮抑制血管新生活性成分的虚拟筛选

陈锡欣+刘怡+黄荣+赵林林+陈磊+王淑美

[摘要]血管新生是一个动态的、多步骤的过程，现在已知大约70种疾病与血管新生紊乱相关。作者前期研究及文献报道均表明苦参黄酮类成分有明显抑制血管新生的作用，但其药效物质基础和作用机制尚未明确。该研究应用分子对接技术虚拟筛选苦参黄酮抑制血管新生的药效物质，搜集现已分离鉴定的126个苦参黄酮类化合物组成配体数据库，选择VEGFa，TEK，KDR等6个与血管新生密切相关的靶点组成受体数据库，以DrugBank中对各靶点有抑制作用并已上市的小分子药物为参照，设定各靶点对应的已上市小分子药物最低打分为阈值，应用Discovery Studio 25（DS25） 软件的LibDock模块进行分子对接， 虚拟筛选出打分高于阈值且排名前10%的化合物共37个。对比分析了原配体、已上市药物和苦参黄酮作用于各靶点的主要活性位点，初步揭示了苦参黄酮抑制血管新生的作用机制，为研发血管新生抑制剂类药物提供了一定的参考。

[关键词]苦参黄酮； 抗血管新生； 分子对接； 虚拟筛选

[Abstract]Angiogenesis is a dynamic， multistep process It is known that about 70 diseases are related to angiogenesis Both the experimental and the literature reports showed that Sophora flavescens inhibit angiogenesis significantly， but the material basis and the mechanism of action have not been clear In this study， molecular docking was used for screening of antiangiogenesis flavonoids from the roots of S flavescens One handred and twentysix flavonoids selected from S flavescens were screened in the docking ligand database with six targets（VEGFa，TEK，KDR，Flt1，FGFR1 and FGFR2） as the receptors In addition， the smallmolecule approved drugs of targets from DrugBank database were set as a reference with minimum score of each target′s approved drugs as threshold The LibDock module in Discovery Studio 25 （DS25） software was applied to screen the compounds As a result， 37 compounds were screened out that their scores were higher than the minimum score of approved drugs as well as being in the top of 10% At last the mechanism of flavonoids antiangiogenesis was preliminarily revealed， which provided a new method for the development of angiogenesis inhibitor drugs

[Key words]flavonoids from Sophora flavescens； antiangiogenesis； molecular docking； virtual screening

血管新生是一個动态的、多步骤的过程，现在已知大约 70 种疾病与血管新生紊乱相关[1]，肿瘤、糖尿病、动脉粥样硬化等重大疾病的病理环节都与血管新生有关[24]，故研究血管新生抑制剂具有重要意义。血管新生主要过程包括血管基底膜降解，血管内皮细胞的激活、增殖、迁移，以芽生方式在原有血管基础上重构新的血管和血管网，这一过程主要由可溶性血管生成刺激因子诱导[510]，如VEGF，KDR，VEGF可增加血管通透性，其受体KDR是抗VEGF受体疗法的一种主要靶点，为早期成血管细胞发育所必需；FLT1，使成血管细胞形成血管；FGF，可促进血管细胞增殖、迁移；TEK，是促血管生成素（Ang）受体，具促进血管芽生式新生作用。上述因子及受体已成为研究抑制血管新生的重要靶点[711]。

苦参为豆科槐属植物苦参Sophora flavescens Ait的干燥根，现代药理研究表明其黄酮类成分具有抗肿瘤[1215]、抗糖尿病血管并发症（糖尿病肾病、糖尿病视网膜病）的作用[1620]。张秀莉[21]在对苦参中黄酮化合物（2S）8异戊烯基7，2′，4′三羟基5甲氧基二氢黄酮的研究中发现，该化合物质量浓度达到40 mg·L-1时能明显抑制ECV304细胞的增殖、迁移、黏附和管样结构形成，并能明显抑制细胞内ROS生成和血管内皮生长因子（VEGF）的表达，流式细胞术分析表明该化合物可阻滞ECV304细胞周期在G1期；同时，检索发现在2011年有关于苦参酮（kurarinone）抗血管新生的专利授权[22]；本研究在前期实验中发现苦参黄酮部位可以明显抑制斑马鱼胚胎血管新生的发生，值得进一步明确其具体药效物质基础、挖掘活性更好的黄酮小分子，并阐明其药理作用机制。分子对接是将配体小分子放到受体活性位点处，通过变化配体小分子构象，按照几何、能量及化学环境互补的原则来评价配体小分子与受体互相作用的强弱，寻找配体小分子与受体作用的最佳构象，并预测其结合模式、亲和力的方法[23]。本研究应用分子对接技术，以DrugBank中对各靶点确证有抑制作用并已上市的小分子药物为参照，设定各靶点对应的已上市小分子药物最低打分为阈值，对已报道的苦参黄酮化合物进行研究，优选出对血管新生有抑制作用的化合物，并初步阐释其作用机制，为研发血管新生抑制剂类药物提供一定的参考。

1材料与方法

11程序系统本研究所有工作均在Microsoft Windows XP Professional 操作系统中完成，采用ChemBioOffice2004程序（美国剑桥公司）中的ChemBioDraw模块、Accelrys公司的Discovery Studio 25。参数设置除非特殊指明，均为默认值。

12受体数据库的组建选取6个与血管新生相关的靶点，分别为内皮血管生长因子a（VEGFa）、血管生长素受体（TEK）、内皮生长因子受体2（KDR）、内皮生长因子受体1（FLT1）、成纤维细胞生长因子受体1（FGFR1）和成纤维细胞生长因子受体2（FGFR2），从RCSB PDB数据库（http：//wwwrcsborg/pdb/home/homedo）搜索并下载对应的蛋白晶体结构，PDB 编号及原配体与靶点残基作用情况，见表1。蛋白晶体前处理及结合口袋的定义：删除水分子、原配体分子及其非相关的蛋白质构象，经Clean Protein工具处理，再加CHARMm力场进行能量优化，定义蛋白为受体，以它的原配体位置为中心，选择半径5 范围的残基为活性残基，将其定义sphere球，修改sphere球半径为15 ，此范围内的空腔为结合口袋，最后保存备用。

13配体数据库的组建通过检索文献收集[2425]和从TCMSP数据库[26] （http：//lspnwsuafeducn/tcmspphp）中搜集得到苦参黄酮类化合物126个，将其二维结构通过ChemDraw转为三维结构。将三维的化合物结构导入对接软件DS25中，加CHARMm力场进行能量优化，保存作为分子对接的配体分子集。

作参照的小分子药物的准备：DrugBank是整合了药物的分子结构、作用靶点等信息的数据库[27]。从DrugBank搜索对上述6个靶点有抑制作用并已批准上市（状态为approved）的小分子药物，见表2，下载其化合物结构，同苦参黄酮化合物前处理后，保存作为参照分子集。

14苦参黄酮类成分与关键靶点对接将上述组建的配体和受体导入DS25，调用LibDock对接模块，设定对接的受体、配体及活性坐标位置后，修改对接参数Conformation Method：BEST，Docking Preferences：High Quality，其余均为默认值；同样的参数条件，将已上市小分子药物与受体进行对接。对接完成后，将结果按LibDock Score打分由大到小排序，以靶点对应已上市小分子药物最低的对接打分为阈值，打分高于阈值的予以保留，作为每个靶点的候选化合物。

15对接结果分析分析原配体、已上市药物和苦参黄酮候选化合物作用于各靶点的作用模式，得到与各靶残基作用的情况，如产生的氢键作用，对比原配体、已上市药物和苦参黄酮候选化合物三者主要作用残基的相似性，推测拟筛的化合物是否具有与已上市药物相似的活性作用。

16对接方法可行性验证含有原配体的蛋白晶体复合结构，若将原配体抽离，然后按设定的参数对接回其结合口袋，计算对接后构象与原配体结构的均方根偏差值（RMSD），一般认为RMSD≤2 时[28]，说明该套参数能较好地重现此配体与受体的结合模式，认为该对接方法可行。

2结果与分析

21对接结果从上述得到的候选化合物中筛选出打分高于阈值且各靶点对接打分最高的10%（前13名）作为最具潜力的候选化合物，删除重复项后共37个，具体结果见表3。

22结果分析分析以上37个候选化合物与各靶点相互作用模式，统计得出化合物与靶点相互作用的残基见表4，残基右上标为该残基与化合物产生氢键或π相互作用的个数，数字越大，说明与该残基相互作用的化合物就越多。

分析已上市小分子药物对接后与各靶点的相互作用模式，得出已上市小分子药物与靶点相互作用

的残基见表5。

23可行性验证结果作者选取的6个靶点均为含有原配体的复合结构晶体，将原配体抽离，再对接回其结合口袋，计算对接后构象与原配体结构的RMSD，都小于 2 ，比较对接构象和原配体位置，发现两者几乎重叠，见表6，说明该对接方法、所选用的晶体结构及参数的设定可行。

3讨论

DS25中活性位点的定义有3种途径：一是DS25中自动搜索活性位点的算法，计算机搜索出几种或十几种Binding Site供参考，通常把第一个也是最大的一个选作为对接位点；二是根据文献报道的活性残基为中心定义活性位点；三是含原配体的复合质晶体结构，以原配体位置为中心，指定半径范围内的残基为活性位点。本研究采用第3种方法以原配体位置为中心确定受体蛋白的活性位点。

該研究采用DS25中的LibDock对接模块为高通量的分子库筛选方法，其根据蛋白受体网格点的功能来定义作用热区（hotspots），然后将配体分子构象对接到热区所在的活性口袋中[2931]。这为大数据分子虚拟筛选提供了方便快捷的手段。

分析原始配体、已上市小分子药物和候选化合物与受体的相互作用模式，见表1，4，5。观察表中数据，发现原配体、已上市小分子药物和候选化合物的重要作用残基具有很大程度的相似性。

VEGFa（5hhd）：原配体与其氢键作用的残基为A：cys54和 B：lys41，而A：cys54恰恰也是已上市小分子药物和候选化合物与VEGFa作用最多的残基，并且候选化合物与已上市小分子药物作用模式相似，在A：cys54，B：ser43，B：phe40，A：cys61产生氢键作用，在B：phe29，A：glu57形成π相互作用。TEK（2p4i）：原配体为TEK的抑制剂[32]，其关键活性残基为Ala905，Glu982，Phe983，已上市小分子药物与TEK对接结果显示Ala905，Lys855，Arg987为重要活性残基，候选化合物作用最多的残基为Lys855，Asp982，Ala905，Arg987。

KDR（3wzd）：原配体与Asp1046，Cys919，Glu885残基形成氢键，与Lys868构成π相互作用，已上市小分子药物主要在Asp1046上形成氢键，候选化合物则主要与Cys919，Gly846，Asp1046形成氢键以及与Phe918，Lys868构成π相互作用。查阅文献发现Oguro Y等[33]对imidazo[1，2b]pyridazine及其衍生物的抗血管新生作用及其机制的研究印证了对残基Cys919的模拟，其采用共晶结构分析方法，发现imidazo[1，2b]pyridazine母核上N1氮原子与KDR残基Cys919的NH形成氢键为两者的结合方式，这一结合模式在对KDR均有强烈抑制活性的多个衍生物上得到了重现。Abreu R M等[34]的研究则表明，选择Lys868，Glu885，Cys919和Asp1046等4个KDR的残基可有效地设计关于KDR靶点的药物。综上可见候选化合物作用模式与原配体、已上市小分子药物和文献报道的作用模式均有相似之处。

FLT1（3hng）： Mathi P等[35]实验证明白皮杉醇具有抑制血管新生的活性，并预测其机制为与靶点FLT1的Cys912和Glu878残基形成直接的氢键作用[32]。已上市小分子药物作用的主要残基为Cys912和Glu878。原配体氢键作用的残基为Cys912，Glu878，Asp1040。可见与残基Cys912和Glu878形成氢键作用是FLT1抑制剂作用的共通模式。而候选化合物与FLT1作用模式主要为：与Lys861形成π相互作用、与Cys912，Asp1040，Ile1019形成氢键作用，作用模式相似于文献报道的、原配体的及已上市小分子药物的；值得一提的是，苦参酮的对接结果显示，其与FLT1的对接打分相对较高，作用残基为Asp1040和Arg1021。

FGFR1（4rwj）：已上市小分子药物显示的重要残基与原配体的相似，在Ala564和Gly485上形成氢键，候选化合物亦表现与Ala564和Gly485的氢键作用。

FGFR2（3ri1）：候选化合物与原配体及已上市小分子药物都表现了与残基Lys517的π相互作用，可见Lys517为FGFR2的重要残基，且候选化合物在Ala567上形成氢键与原配体作用模式一致。

综上可见苦参黄酮候选化合物具有与原配体及已上市小分子药物相似的作用模式，且与文献报道的部分靶点相关活性残基相似，因此推测其会表现为相似的活性作用，其药理药效作用有待进一步验证。

4结论

本研究首次将分子对接应用到苦参黄酮类化合物的药效物质筛选中，从现有的126个苦参黄酮类化合物中虚拟筛选出37个潜在活性的化合物，完成了对抑制血管新生的化合物初筛，相对于传统筛选，节约了大量时间、精力和物力。并初步探讨了苦参黄酮抑制血管新生的作用机制，为其药效学研究和血管新生抑制剂类药物的研发提供参考。

[致谢] 该论文得到中山大学罗海彬教授的帮助。

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