IL-33及其受体ST2在D-GalN/LPS诱导的急性肝功能衰竭小鼠中的表达及意义

姜绍文　林兰意　项晓刚　卢捷　王芃　莫瑞东　刘昱含　蔡伟　王晖　谢青

200025　上海交通大学医学院附属瑞金医院感染科



·论著·

IL-33及其受体ST2在D-GalN/LPS诱导的急性肝功能衰竭小鼠中的表达及意义

姜绍文林兰意项晓刚卢捷王芃莫瑞东刘昱含蔡伟王晖谢青

200025上海交通大学医学院附属瑞金医院感染科

【摘要】目的研究D-GalN/LPS诱导的急性肝衰竭小鼠中IL-33及其受体ST2的表达及意义。方法腹腔注射D-GalN(900 mg/kg)/LPS(10 μg/kg)诱导急性肝衰竭小鼠模型。通过q-PCR、Western印迹、ELISA、免疫组织化学染色等实验技术检测IL-33及其受体ST2在不同时间点的动态变化。结果急性肝衰竭小鼠肝内的IL-33 mRNA水平随着肝损伤加重不断增高，肝衰竭时上升至峰值，D-GalN/LPS诱导后7 h，肝组织表现为明显坏死。而肝内ST2L受体蛋白含量在D-GalN/LPS诱导后3 h，未出现明显的肝细胞损伤前已显著升高，之后不断下降，到7 h肝衰竭时其水平降至最低。此外，外周血清中IL-33蛋白水平亦随时间持续升高，在7 h肝衰竭时达高峰，与IL-33 mRNA的动态变化相一致。然而血清sST2蛋白水平在0 h和3 h肝细胞损伤的早期无明显差异，但在5 h肝细胞损伤的中期却显著升高，之后又显著降低。免疫组织化学染色显示急性肝衰竭小鼠肝内IL-33来源于血管内皮细胞和肝血窦细胞核内。结论IL-33及其受体ST2随时间的动态变化与急性肝衰竭的病情进展存在紧密联系，提示IL-33/ST2轴参与了急性肝衰竭的发生发展过程。

【关键词】IL-33；ST2L；sST2；急性肝功能衰竭；动态表达

急性肝功能衰竭是临床常见的严重肝病症候群，进展迅速，病死率高达60%以上，严重威胁人类健康[1]。引起急性肝衰竭最常见的原因包括对乙酰氨基酚过量、特异性药物反应和肝炎病毒感染[2]。目前急性肝衰竭唯一有效的治疗手段仍然是肝移植，但肝源稀缺、费用过高等因素极大地限制了其在临床上的广泛应用。因此，及早地阐明急性肝衰竭的发生发展机制，找到针对性的治疗靶点，有效地阻止病情进展恶化，对于挽救患者生命而言至关重要。既往研究已证实，全身性炎性反应在急性肝衰竭的发病过程中发挥举足轻重的作用。TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-18等促炎因子持续造成肝细胞损伤，引发炎性级联反应，最终导致多器官功能衰竭[3, 4]。

IL-33 (Interleukin-33)是IL-1家族的第11个新成员，又称IL-1F11[5]。不但可作为核内转录因子参与基因的表达调控，还可作为细胞因子被分泌到胞外，激活靶细胞，启动免疫反应[6]。研究表明，IL-33参与多种肝脏疾病的发生过程，包括病毒性肝炎、肝脏纤维化和肝细胞肝癌[7-9]。然而，关于IL-33/ST2轴在急性肝衰竭中作用的相关研究较少。本研究通过观察急性肝衰竭小鼠模型中IL-33及其受体ST2的动态表达，探究IL-33/ST2轴是否参与急性肝衰竭的发生发展过程，为其治疗寻找新的潜在靶点。

资料和方法

一、动物和试剂

Balb/C清洁级小鼠，雄性，6～7周龄，体质量20～25 g，购自中国科学院上海实验动物中心，在上海交通大学附属瑞金医院动物房清洁级环境中适应1周后开始试验。试验前12 h禁食不禁水，给药后正常进食进水。

D-GalN和LPS购自美国Sigma公司，TRIzol试剂购自美国Invitrogen公司，反转录试剂盒和SYBR Green Taq试剂盒购自日本Takara公司，IL-33和ST2的ELISA试剂盒以及一抗购自美国R&D公司。

二、急性肝衰竭小鼠模型的建立

分别按照D-GalN 900、500、400、300 mg/kg和LPS 10 μg/kg的药物浓度，给予小鼠腹腔注射，给药后0、3、5、7 h分别处死6只小鼠，留取血清和肝组织。血清存于-80 ℃，一部分肝组织在液氮速冻后存于-80 ℃冰箱，另一部分肝组织甲醛固定。

三、RNA抽提、反转录和q-PCR

用TRIzol试剂提取肝组织总RNA，具体操作按照说明书进行；测定总RNA浓度，配制成等浓度RNA溶液。用反转录试剂盒和SYBR Green Taq试剂盒完成反转录和q-PCR试验，具体操作按照试剂盒说明书进行。IL-33引物由铂尚公司合成，上游引物为5′-ATTTCCCCGGCAAAGTTCAG-3′，下游引物为5′-AACGGAGTCTCATGCAGTAGA-3′。

四、免疫印迹试验

肝组织匀浆后离心、取上清，经BCA法测定蛋白浓度，制备蛋白样本，使相同体积溶液内含有相同质量的蛋白。配制10%的胶，完成蛋白样品和marker上样，电泳。再经过350 mA电流 70 min，将蛋白转移至PVDF膜。在含5%脱脂奶粉的TBST溶液中常温封闭1 h。TBST溶液漂洗，5 min × 3次。ST2一抗(1∶2 000)4℃ 孵育过夜。TBST溶液漂洗同前，抗山羊二抗(1∶5 000，碧云天)常温孵育1 h。TBST溶液漂洗同前，ECL显影液显影，曝光拍照。

五、酶联免疫吸附试验

血清原液检测IL-33，血清1∶20稀释检测ST2，具体操作严格按照R&D试剂盒说明书进行。

六、免疫组织化学染色

5 μm厚的连续石蜡切片常规脱蜡至水，柠檬酸-EDTA修复液98 ℃抗原修复30 min，冷却至室温，TBST缓冲液浸洗10 min × 3次，3%过氧化氢室温10 min灭活内源性过氧化物酶，TBST溶液浸洗同前，0.2%曲拉通室温5 min，TBST溶液浸洗同前，二抗同源血清封闭30 min，IL-33一抗(1∶100)4 ℃ 孵育过夜，TBST溶液浸洗同前，二抗(1∶200)37 ℃孵育30 min，TBST溶液浸洗同前，DAB显色，苏木素复染、分色，冲水返蓝，梯度脱水、透明，中性树脂封片。阴性对照以PBS缓冲液代替一抗。

结果

一、D-GalN 900 mg/kg 联合LPS 10 μg/kg腹腔注射建立急性肝衰竭小鼠模型

不同剂量组合的D-GalN/LPS腹腔注射后小鼠的24 h生存曲线见图1a。D-GalN 900 mg/kg 联合LPS 10 μg/kg可以诱导高死亡率的小鼠急性肝衰竭，与临床急性肝衰竭情况较为接近。D-GalN 900 mg/kg 联合LPS 10 μg/kg腹腔注射后，分别在0、3、5、7 h时间点动态观察小鼠肝脏的转氨酶、肉眼观和HE染色病理改变。随着肝损伤的加重，ALT和AST逐渐升高，至7 h达高峰(图1b)。从0 h到7 h，小鼠肝脏的体积因淤血逐渐增大，色泽由粉红色渐变为暗红色，5 h肝脏表面出现散在点状出血点，7 h肝脏表面满布颗粒状出血点(图1c)。肝组织病理HE染色显示，3 h肝小叶结构健全，部分肝细胞肿胀或出现空泡变性；5 h部分肝细胞发生凋亡，并出现组织内炎性细胞浸润及显著的点状、小片状坏死，肝血窦内开始出现淤血；7 h肝小叶结构完全丧失，肝细胞大块坏死，汇管区大量炎性细胞浸润，肝血窦内充斥血细胞或闭塞不通，微循环障碍严重(图1D-G)。

注：A为不同剂量组合的D-GalN/LPS注射后小鼠的24 h生存曲线；B为小鼠血清ALT和AST的动态变化；C为小鼠肝脏肉眼观的动态变化；D-G分别为0、3、5、7 h的小鼠肝组织(HE×400)

图1D-GalN/LPS诱导的急性肝衰竭建模成功

二、IL-33及其受体ST2在急性肝衰竭小鼠肝内的动态变化

如图2所示，随着D-GalN /LPS诱导后肝细胞损伤的加重，肝内IL-33 mRNA水平不断增高，在7 h肝细胞出现大块坏死并已达到肝衰竭时, 其表达水平达到高峰。而肝内ST2L受体蛋白含量在D-GalN /LPS诱导后3 h，肝细胞损伤的早期已经显著升高，之后开始不断下降，到7 h肝衰竭时下降至最低水平。

三、IL-33及其受体ST2在急性肝衰竭小鼠外周血清中的动态变化

如图3所示，外周血清中IL-33蛋白水平随时间持续升高，在7 h肝衰竭时达到最高水平，与IL-33 mRNA的动态变化相一致。与此不同的是，血清中ST2蛋白水平在0 h和3 h肝细胞损伤的早期无明显差异，但在5 h肝细胞损伤的中期却出现显著的升高，之后又明显下降。

四、急性肝衰竭小鼠IL-33的肝内细胞来源

免疫组化结果显示，健康小鼠肝内IL-33主要定位于血管内皮细胞和肝血窦细胞核内(图4a)。肝衰竭小鼠肝脏内IL-33的细胞来源也是这两种细胞，定位并未发生改变(图4b)。

注：A.肝内IL-33 mRNA水平随时间逐步升高；B. 肝内ST2L蛋白含量在3 h增加明显，之后逐步减少，至7 h达最低水平；C. 肝内ST2L蛋白Western 印迹对应的灰度直方图

图2肝内IL-33和ST2L随病情进展的动态变化

注：A. 血清IL-33水平逐渐攀升，至7 h达最高水平；B. 血清ST2在5 h出现峰值后转而下降

图3外周血清中IL-33和可溶型sST2蛋白随时间的动态表达谱

注：A. 健康小鼠肝内IL-33表达；B. 肝衰竭小鼠肝内IL-33表达

讨论

尽管近年来随着医疗技术的发展，急性肝衰竭患者的预后得到了一定改善，但目前病死率仍很高，其发生发展的具体机制亦不明确。全身炎性反应无疑在急性肝衰竭的发病过程中扮演至关重要的角色。IL-33是一种新近发现的、具有多种生物学效应的炎性细胞因子，属于IL-1超家族。研究证实，IL-33/ST2轴不仅可诱导Th2型免疫，参与过敏性疾病、纤维化疾病和寄生虫感染等疾病的发展过程[8, 10-12]，还可通过促进Th1型免疫和CD8+T淋巴细胞在抗病毒和抗肿瘤免疫中发挥保护性作用[9, 13]。本研究通过D-GalN/LPS诱导的急性肝衰竭小鼠模型，发现IL-33及其受体ST2随时间动态变化与急性肝衰竭的病情进展存在紧密联系，说明IL-33/ST2轴参与了急性肝衰竭的发生发展过程，这或可为急性肝衰竭的治疗提供新的潜在靶点。

D-GalN/LPS被广泛用于急性肝衰竭发病机制以及治疗干预的研究。通过观察记录不同剂量组合的D-GalN /LPS腹腔注射后小鼠24 h生存曲线，发现D-GalN 900 mg/kg 联合LPS 10 μg/kg所对应的存活率与临床情况更为接近。

随着肝细胞损伤的不断加重，小鼠肝内IL-33 mRNA含量不断增高，至7 h肝组织表现为大块坏死时上升至峰值。而肝内ST2L蛋白在3 h肝细胞损伤的早期即达高峰，随后持续减少，在7 h肝衰竭时降至最低。外周血清中IL-33蛋白水平的动态变化与肝内IL-33 mRNA变化相吻合，也随时间不断升高，在7 h达高峰。血清中ST2蛋白水平在0 h和3 h肝细胞损伤的早期无明显差异，但在5 h肝细胞损伤的中期却出现明显升高，之后显著降低。研究证实，IL-33有两种存在形式：IL-33前体和IL-33成熟体，分别位于细胞核内和细胞外。IL-33的受体ST2也至少有两种亚型：跨模型ST2L与可溶型sST2，前者存在于靶细胞膜上，后者则存在于外周血清中。随着肝衰竭病情进展，肝细胞由点状、小片状的凋亡、坏死发展为大面积的凋亡、坏死，肝小叶结构崩塌，大量炎性细胞浸润，肝血窦充斥血细胞或闭塞不通，微循环障碍严重，因此IL-33前体作为一种警戒素被释放到细胞外。随时间推移，IL-33的血清水平逐步攀升。而表达于小鼠肝细胞膜上的ST2L随着肝细胞坏死释放入血[14]，成为血清中sST2的一部分，所以在5 h肝内ST2L开始减少，而sST2水平在5 h出现一次跃升。之后在7 h，肝内ST2L进一步减少，可溶型sST2下降。这或许与重型肝炎时出现的“胆酶分离”原理类似，疾病末期肝细胞大量坏死，肝内合成ST2L的能力减弱，而血清中的sST2部分被降解，引起sST2水平的下降。

IL-33在肝脏内的细胞来源可因疾病状态的差异而出现不同。肝细胞肝癌时，IL-33主要定位于效应记忆性CD8+T淋巴细胞[9]。肝脏纤维化时，激活的肝星状细胞为IL-33的主要细胞来源[8]。而在Con-A诱导的小鼠急性肝损伤模型中，IL-33则定位于肝细胞核内[15]。健康小鼠肝内IL-33主要表达于血管内皮细胞和肝血窦细胞核内，肝衰竭肝脏内IL-33的细胞来源也是这两种细胞，定位并未发生改变。

在急性肝衰竭的发展过程中，TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-18等引发炎性级联反应，造成肝细胞大量凋亡，最终导致多器官功能衰竭。在Con-A诱导的小鼠急性肝损伤中，注射IL-33可下调TNF-α、IFN-γ和IL-17等促炎因子的血清水平，减轻产生这些细胞因子的免疫细胞在肝内的浸润程度，包括CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞和NK细胞[16]。还可抑制促凋亡蛋白caspase-3和BAX的激活，同时上调抗凋亡蛋白Bcl-2和p-ERK的表达，从而缓解肝损伤。IL-33可通过激活NF-κB和p38 MAPK信号通路，增强Bcl-2和cyclin D1的蛋白表达，从而在肝脏缺血缺氧损伤中发挥重要的保护作用[14]。肝衰竭时肠道的屏障功能受到削弱，肠菌移位，引起内毒素血症，形成二次打击，进一步加重了肝衰竭。肝衰竭时高水平的促炎因子，如TNF-α和IL-6，可诱导sST2的生成[17]。一方面，过表达的血清sST2已被证明能与巨噬细胞相结合，通过下调Toll样受体4(TLR4)，抑制促炎因子(IL-6、IL-12和TNF-α等)的表达和Th1型细胞反应，有助于对内毒素血症形成耐受[18-19]。另一方面，血清sST2作为一种可溶性诱饵受体，可中和外周游离的IL-33，防止IL-33全身性效应的发生[6]。动物实验显示，若通过基因改造使IL-33染色质锚定结构缺失，小鼠将形成高IL-33血症，引起多器官严重的炎性细胞浸润，最终导致致死性炎症[20]。

综上所述，IL-33及其受体ST2随时间的动态变化与急性肝衰竭的病情进展间存在紧密的联动关系，说明IL-33/ST2轴参与了急性肝衰竭的发生发展过程。IL-33/ST2轴有望成为急性肝衰竭临床治疗的潜在靶点，为救治急性肝衰竭患者提供希望。

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(本文编辑：钱燕)

The expression profiles and significance of IL-33 and its receptor ST2 in a murine model of D-GalN/LPS -induced acute liver failure

JIANGShao-wen,LINLan-yi,XIANGXiao-gang,LUJie,WANGFan,MORui-dong,LIUYu-han,CAIWei,WANGHui,XIEQing.DepartmentofInfectiousDisease,RuijinHospitalAffilicatedtoMedicalColledgofShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai200025,China.

【Abstract】ObjectiveTo investigate the expression profiles and implication of IL-33 and its receptor ST2 in a murine model of acute liver failure (ALF) induced by D-GalN/LPS. MethodsThe ALF murine model was set up by intraperitoneal injection of D-GalN (900 mg/kg)/LPS(10 ug/kg), and confirmed by histopathology and biochemistry. Dynamic expression profiles of IL-33 and its receptor ST2 in ALF murine model were investigated by quantitative polymerase chain reaction (q-PCR), western-blot, enzyme-linked immune-sorbent assay (ELISA) and immunohistochemistry at different time points, respectively. ResultsThe murine model of ALF was successfully established by intraperitoneal injection of D-GalN (900 mg/kg)/LPS(10 ug/kg). The mRNA level of intra-hepatic IL-33 continuously increased with the progression of ALF, and reached the peak at 7 h after D-GalN/LPS challenge. Compared to baseline, intra-hepatic ST2L protein level was markedly up-regulated at 3 h, which was before the occurrence of obvious hepatocytes damage. However, it declined later on and fall to the lowest at 7 h. In addition, it was observed that IL-33 protein level in serum was elevated sustainedly over time and reached the highest level at 7 h, which was consistent with its dynamic mRNA changes. In contrast, the serum level of sST2 had no significant differences between 0 h and 3 h at the early stage of liver damage, but showed an obvious rise to climax at 5 h in the medium-term of liver damage, and then was followed by a drastic decline. The immunohistochemistry results confirmed that intra-hepatic IL-33 was mainly located in the nucleus of endothelial cells and sinusoidal cells in ALF mouse liver. ConclusionThe dynamic changes of IL-33 and its receptor ST2 in ALF mice are closely linked with the progression of acute liver failure, suggesting that IL-33/ST2 axis is indeed involved in the process of ALF. This might provide a novel potential target for ALF treatment.

【Key words】IL-33; ST2L; sST2; ALF; Dynamic expression

(收稿日期：2015-12-31)

Corresponding author:XIE-Qing,Email:xieqingrjh@163.com

通信作者：谢青，Email：xieqingrjh@163.com

基金项目：国家自然科学基金(81171569, 81300316, 81570535)，国家十二五重大专项(2012ZX10002003-003, 2012ZX10002007-002, 2012ZX10002007-003-008)，国家临床重点专科建设项目 (感染病学)，上海市卫生和计划生育委员会课题(20144329)，上海市学科带头人计划(12XD1403600)，中国肝炎防治基金会王宝恩肝纤维化研究基金项目(CFHPC20131056)。