QIAGEN实时PCR与COBAS TaqMan检测血清HBV DNA预测慢性乙型肝炎肝组织病理状态的性能比较

张占卿　陆伟　王平安　王雁冰　周新兰　丁荣蓉　李秀芬　黄丹

201508　上海市公共卫生临床中心肝炎二科(张占卿，陆伟，王雁冰，周新兰，丁荣蓉，李秀芬，黄丹)；上海新培晶医学检验所(王平安)



·论著·

QIAGEN实时PCR与COBAS TaqMan检测血清HBV DNA预测慢性乙型肝炎肝组织病理状态的性能比较

张占卿陆伟王平安王雁冰周新兰丁荣蓉李秀芬黄丹

201508上海市公共卫生临床中心肝炎二科(张占卿，陆伟，王雁冰，周新兰，丁荣蓉，李秀芬，黄丹)；上海新培晶医学检验所(王平安)

【摘要】目的比较QIAGEN实时PCR与COBAS TaqMan检测血清HBV DNA水平预测慢性乙型肝炎肝组织病理状态的性能。方法慢性乙型肝炎患者278例，其中HBeAg阳性和阴性分别为162例和116例。采用QIAGEN实时定量PCR和COBAS TaqMan系统检测血清HBV DNA。肝组织病理学诊断采用Scheuer评分系统，其中病理学分级和分期包括G0～G4和S0～S4。结果血清HBV DNA(QIAGEN)和HBV DNA(COBAS)在HBeAg阳性患者G2与G3，S1、S2、S3与S4之间的差异有统计学意义(P均<0.05)；在HBeAg阴性患者G1与G2、G3，S1与S2、S3、S4之间的差异有统计学意义(P均<0.05)。血清HBV DNA(QIAGEN)与HBV DNA(COBAS)定量的不一致率，在HBeAg阳性患者G1-2、G3和S1-3、S4分别为4.24%(5/118)、9.09%(4/44)和3.68%(5/136)、7.69%(2/26)，在HBeAg阴性患者G1、G2-3和S1、S2-4分别为6.02%(5/83)、3.03%(1/33)和3.29%(2/61)、3.64%(2/55)。血清HBV DNA(QIAGEN)和HBV DNA(COBAS)预测HBeAg阳性患者≥G3、≥S4的ROC曲线下面积分别为0.645和0.695、0.703和0.755，预测HBeAg阴性患者≥G2、≥S2的ROC曲线下面积分别为0.848和0.817、0.756和0.756。血清HBV DNA(QIAGEN)和HBV DNA(COBAS)预测HBeAg阳性患者≥S4的最佳截断值分别为≤3.784×106 IU/mL和≤6.668×107 IU/mL，对应的灵敏度、特异度分别为0.654和1.000、0.735和0.581；预测HBeAg阴性患者≥G2的最佳截断值分别为≥5.821×103 IU/mL和≥9.311×103 IU/mL，对应的灵敏度、特异度分别为0.970和0.909、0.614和0.651。结论血清HBV DNA预测肝组织病理状态的特点为预测HBeAg阴性患者≥G2的效能最大，并且血清HBV DNA(QIAGEN)与HBV DNA(COBAS)预测HBeAg阴性患者≥G2的性能有高度一致性。

【关键词】HBV DNA定量；QIAGEN试剂；COBAS TaqMan系统；慢性乙型肝炎；肝组织；病理学

虽然HBV感染宿主的免疫应答模式和机制尚未充分阐明，但血清HBsAg、HBcrAg、HBV DNA和抗-HBc水平在慢性HBV感染史的不同阶段存在差异[1-6]。研究发现，血清HBsAg、HBcrAg水平和HBV DNA对慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B, CHB)患者的肝组织病理状态有预测意义，但不同研究的结果之间存在差异[7-16]。除研究对象的基线特征、样本含量和病理学诊断的偏倚外，研究指标的检测方法和试剂性能也可能是影响其预测效能的一个重要因素。本文采用QIAGEN实时PCR和COBAS TaqMan检测CHB患者血清HBV DNA，进一步评价血清HBV DNA预测CHB肝组织病理状态的效能，同时探讨两种方法检测血清HBV DNA定量预测CHB肝组织病理状态性能的一致性。

资料和方法

一、研究对象

2012年1月至2014年12月上海市(复旦大学附属)公共卫生临床中心住院的CHB患者278例，其中HBeAg阳性和阴性分别为162例和116例。HBeAg阳性患者中，男109例，女53例，男∶女= 2.1∶1；年龄14～66岁，平均(33.2±9.3)岁；HBeAg阴性患者中，男75例，女41例，男∶女= 1.8∶1；年龄17～63岁，平均(41.8±12.4)岁。诊断符合2010年中华医学会肝病学分会、感染病学分会联合修订的《慢性乙型肝炎防治指南》中的标准。所有患者均无失代偿期肝病的临床表现和实验室依据。合并其他病毒性肝炎、药物性肝病、遗传性肝病、血吸虫性肝病以及自身免疫性疾病、内分泌与代谢疾病、血液系统疾病，近6个月内接受干扰素、核苷(酸)、甾体激素类药物治疗的患者被排除。

二、病理学诊断

肝组织活检采用1秒钟经皮肝穿刺法，标本采集后立即置塑料标本管内冰冻送检。肝组织置塑料包埋盒中，进行中性甲醛固定、梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡浸入和包埋、切片，苏木素-伊红染色和网状纤维染色。肝组织标本的质量评价和肝组织病理学诊断由1名有经验的病理学医师独立完成。肝组织病理学诊断采用Scheuer评分系统，肝组织病理学分级包括G0～G4五级，分期包括S0～S4五期。

三、血清HBsAg、HBeAg和HBV DNA检测

所有患者于肝穿刺前后1周内早晨空腹采集静脉血，分离血清。血清HBsAg和HBeAg采用Abbott Architect I2000及其配套试剂检测，正常参考值下限分别为0.05 IU/mL和1.0 S/CO。血清HBV DNA采用两种方法检测：①QIAGEN实时定量PCR检测，试剂购自深圳QIAGEN生物工程有限公司，线性检测范围5×102～5×107IU/mL；②Roche全自动COBAS TaqMan系统检测，线性检测范围2×10～1.7×108IU/mL。

四、统计学方法

采用SPSS 16.0和Medcalc 15.1软件。血清HBV DNA(QIAGEN)和HBV DNA(COBAS)与肝组织病理学分级和分期的相关性采用Spearman相关分析；血清HBV DNA(QIAGEN)和HBV DNA(COBAS)在不同病理学分级和分期之间的差异比较采用单因素方差分析。血清HBV DNA(QIAGEN)和HBV DNA(COBAS)预测肝组织不同炎症活动度和纤维化程度的ROC曲线下面积比较采用成组样本的Z检验。血清HBV DNA(QIAGEN)与HBV DNA(COBAS)定量之间的一致性分析采用Pearson直线相关、直线回归和Bland-Altman一致性分析。血清HBV DNA(QIAGEN)与HBV DNA(COBAS)预测肝组织相同炎症活动度和纤维化程度的ROC曲线下面积之间的差异比较采用配对样本的Delong非参数检验。

结果

一、血清HBV DNA与肝组织病理学分级和分期的相关性

HBeAg阳性患者，血清HBV DNA(QIAGEN)和HBV DNA(COBAS)与肝组织病理学分级和分期均呈显著负相关(P均<0.01)。HBeAg阴性患者，血清HBV DNA(QIAGEN)和HBV DNA(COBAS)与肝组织病理学分级和分期均呈显著正相关(P均<0.01)。见表1。

二、血清HBV DNA在肝组织不同病理学分级和分期之间的差异

HBeAg 阳性患者，血清HBV DNA(QIAGEN)和HBV DNA(COBAS)在肝组织不同病理学分级和分期之间的差异均有统计学意义(P均<0.05)；其中，血清HBV DNA(QIAGEN)和HBV DNA(COBAS)在G2与G3之间，在S1、S2、S3与S4之间的差异有统计学意义(P均<0.05)。HBeAg 阴性患者，血清HBV DNA(QIAGEN)和HBV DNA(COBAS)在肝组织不同病理学分级和分期之间的差异均有统计学意义(P均<0.05)；其中，血清HBV DNA(QIAGEN)和HBV DNA(COBAS)在G1与G2、G3之间，在S1与S2、S3、S4之间，血清HBV DNA(QIAGEN)在S2与S4之间的差异有统计学意义(P均<0.05)。见表2。

表1　血清HBV DNA(QIAGEN)和HBV DNA(COBAS)与肝组织病理学分级和分期的Spearman相关系数

表2　血清HBV DNA(QIAGEN)和HBV DNA(COBAS)在肝组织不同病理学分级和分期之间的差异比较(lg IU/mL,±s)

注：a:P=0.036; b:P=0.005; c:P=0.001; d:P=0.004; e:P=0.006; f:P=0.006; g:P=0.009; h:P=0.008; i:P=0.000; j:P=0.000; k:P=0.000; l:P=0.000; m:P=0.018; n:P=0.002; o:P=0.000; p:P=0.006; q:P=0.007; r:P=0.002; s:P=0.000

三、血清HBV DNA预测肝组织不同病理状态ROC曲线下面积之间的差异

HBeAg阳性患者，血清HBV DNA(QIAGEN)和HBV DNA(COBAS)预测病理学分级≥G2与≥G3的ROC曲线下面积之间的差异无统计学意义(P均>0.05)，预测病理学分期≥S2与≥S3、≥S3与≥S4、S2与≥S4的ROC曲线下面积之间的差异均无统计学意义(P均>0.05)。HBeAg阴性患者，血清HBV DNA(QIAGEN)和HBV DNA(COBAS)预测病理学分级≥G2与≥G3的ROC曲线下面积之间的差异无统计学意义(P均>0.05)，预测病理学分期≥S2与≥S3、≥S3与≥S4、S2与≥S4的ROC曲线下面积之间的差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表3。

四、血清HBV DNA(QIAGEN)与HBV DNA(COBAS)定量的一致性

不考虑HBeAg状态和病理状态，血清HBV DNA(QIAGEN)与HBV DNA(COBAS)呈显著正相关(P<0.01)；血清HBV DNA(QIAGEN)(log10IU/mL)=1.111+0.782×血清HBV DNA(COBAS)(log10IU/mL)(P<0.01)，见图1A。与血清HBV DNA(COBAS)相比，血清HBV DNA(QIAGEN)定量下向偏倚0.165 log10IU/mL，其95%一致限(limits of agreement, LOA)为-2.035～1.705；其中低于95% LOA下限的不一致率为1.44%(4/278)，高于95% LOA上限的不一致率为1.80%(5/278)，总体不一致率为3.24%(9/278)，见图1B。

表3　血清HBV DNA(QIAGEN)和HBV DNA(COBAS)预测肝组织不同病理状态的ROC曲线下面积

注：*较小的检测结果表明更加阳性的诊断，#较大的检测结果表明更加阳性的诊断

注：血清HBV DNA(QIAGEN)和HBV DNA(COBAS)的测量单位均为log10IU/mL；1A为血清HBV DNA(QIAGEN)与HBV DNA(COBAS)的相关性；1B为血清HBV DNA(QIAGEN)与HBV DNA(COBAS)定量的一致性，图中上、下两条水平实线代表95 %LOA的上、下限，中间水平实线代表血清HBV DNA(QIAGEN)与HBV DNA(COBAS)差值的均值，中间水平虚线代表差值均数为0；HBV DNA(QIAGEN)-HBV DNA(COBAS)：血清HBV DNA(QIAGEN)与HBV DNA(COBAS)的差值；Mean：血清HBV DNA(QIAGEN)与HBV DNA(COBAS)的均值

图1血清HBV DNA(QIAGEN)与血清HBV DNA(COBAS)的相关性和一致性

HBeAg 阳性患者，血清HBV DNA(QIAGEN)与HBV DNA(COBAS)定量的总体不一致率为3.70%(6/162)；其中，病理学分级为G1-2和G3患者血清HBV DNA(QIAGEN)与HBV DNA(COBAS)定量的不一致率分别为4.24%(5/118)和9.09%(4/44)，病理学分期为S1-3和S4患者血清HBV DNA(QIAGEN)与HBV DNA(COBAS)定量的不一致率分别为3.68%(5/136)和7.69%(2/26)。HBeAg 阴性患者，血清HBV DNA(QIAGEN)与HBV DNA(COBAS)定量的总体不一致率为2.59%(3/116)；其中，病理学分级为G1和G2-3患者血清HBV DNA(QIAGEN)与HBV DNA(COBAS)定量的不一致率分别为6.02%(5/83)和3.03%(1/33)，病理学分期为S1和S2-4患者血清HBV DNA(QIAGEN)与HBV DNA(COBAS)定量的不一致率分别为3.29%(2/61)和3.64%(2/55)。见表4。

五、血清HBV DNA(QIAGEN)与HBV DNA(COBAS)预测肝组织相同病理状态的一致性

HBeAg阳性患者，血清HBV DNA(QIAGEN)与HBV DNA(COBAS)预测相同病理学分级≥G2、≥G3和相同病理学分期≥S2、≥S3、≥S4的ROC曲线下面积之间的差异均无统计学意义(P均>0.05)，见表3，图2A、2B。HBeAg阴性患者，血清HBV DNA(QIAGEN)与血清HBV DNA(COBAS)预测相同病理学分级≥G2、≥G3和相同病理学分期≥S2、≥S3、≥S4的ROC曲线下面积之间的差异均无统计学意义(P均>0.05)，见表3，图2C、2D。

六、血清HBV DNA(QIAGEN)与HBV DNA(COBAS)预测肝组织优选病理状态的性能比较

HBeAg阳性患者，血清HBV DNA(QIAGEN)和HBV DNA(COBAS)预测病理学分级≥G3的最佳截断值分别为≤3.981×107IU/mL和≤1.552×108IU/mL，对应的灵敏度、特异度分别为0.795和0.886、0.500和0.508；预测病理学分期≥S4的最佳截断值分别为≤3.784×106IU/mL和≤6.668×107IU/mL，对应的灵敏度、特异度分别为0.654和1.000、0.735和0.581。HBeAg 阴性患者，血清HBV DNA(QIAGEN)和HBV DNA(COBAS)预测病理学

表4　HBeAg阳性和阴性患者血清HBV DNA(QIAGEN)与HBV DNA(COBAS)的Bland-Altman一致性分析

注：偏倚：HBV DNA(QIAGEN)与HBV DNA(COBAS)差值的均值

注：2A为预测HBeAg阳性患者病理学分级≥G3，2B为预测HBeAg阳性患者病理学分期≥S4；2C为预测HBeAg阴性患者病理学分级≥G2，2D为预测HBeAg阴性患者病理学分期≥S2分级≥G2的最佳截断值分别为≥5.821×103IU/mL和≥9.311×103IU/mL，对应的灵敏度、特异度分别为0.970和0.909、0.614和0.651；预测病理学分期≥S2的最佳截断值分别为≥4.027×103IU/mL和≥3.690×103IU/mL，对应的灵敏度、特异度分别为0.836和0.873、0.656和0.590。见表5。

图2　血清HBV DNA(QIAGEN)与HBV DNA(COBAS)预测肝组织不同病理状态的ROC曲线

注：SEN为灵敏度；SPE为特异度；PPV为阳性预测值；NPV为阴性预测值；ACC为准确度

讨论

肝组织病理状态的准确判断是评估慢性肝病病情和预后的前提，对治疗决策和疗效评价具有重要的指导意义。近15年来，肝组织病理状态的无创诊断已经取得许多进展。筛选了一些基于生物学方法的定量血清生物标志和开发了一些基于物理学方法的定量肝脏硬度参数，构建了一些对肝组织病理状态有预测价值的数学模型[17-20]。虽然预测肝组织炎症活动度和纤维化程度的灵敏度、特异度和准确度均有所提高，但仍不能满足让患者避免有创检查的需求。

不同病因的慢性肝病，其肝组织病理状态的演变模式也不完全一致；因此，预测肝组织病理状态的指标可分为疾病特异性和病因特异性指标。但是，迄今为止，肝组织病理状态的无创诊断的研究仍主要集中在疾病特异性指标。作为CHB相关的病因特异性指标，血清HBsAg和HBcrAg水平、HBV DNA载量对HBeAg阳性患者、血清HBcrAg水平和HBV DNA载量对HBeAg阴性患者肝组织病理状态有显著的预测意义；其中，血清HBsAg和HBcrAg水平、HBV DNA载量对HBeAg阳性患者肝组织病理学分级≥G3和分期≥S4的预测效能最大，血清HBcrAg水平和HBV DNA载量对HBeAg阴性患者肝组织病理学分级≥G2和分期≥S2的预测效能最大。有研究认为，血清HBV DNA<20 000 IU /mL的HBeAg阴性患者很少发生肝组织显著纤维化[21-22]。Sanai等[23]的研究指出，血清HBV DNA≥2 000 IU/mL和血清HBV DNA≥20 000 IU/mL预测HBeAg阴性患者血清ALT>40 U/L且METAVIR纤维化分期≥F2的灵敏度、特异度分别为51%、80%和42%、86%。

本研究结果显示，HBeAg阳性患者，血清HBV DNA(QIAGEN)和HBV DNA(COBAS)与肝组织病理学分级和分期均呈显著负相关，在G2与G3和S1、S2、S3与S4之间的差异有统计学意义。HBeAg阴性患者，血清HBV DNA(QIAGEN)和HBV DNA(COBAS)与肝组织病理学分级和分期均呈显著正相关，在G1与G2、G3和S1与S2、S3、S4之间的差异有统计学意义。虽然血清HBV DNA(QIAGEN)和HBV DNA(COBAS)预测HBeAg阳性和阴性患者肝组织病理学分级≥G2与≥G3的ROC曲线下面积之间和预测病理学分期≥S2与≥S3、≥S3与≥S4、S2与≥S4的ROC曲线下面积之间的差异均无统计学意义；但血清HBV DNA载量对HBeAg阴性患者病理学分级≥G2的预测效能最大，对HBeAg阳性患者的病理学分期≥S4的预测效能次之。

关于QIAGEN实时PCR和COBAS TaqMan血清HBV DNA定量一致性的研究文献很少。根据直线相关、直线回归和Bland-Altman一致性分析，CHB患者血清HBV DNA(QIAGEN)与HBV DNA(COBAS)定量具有高度一致性，总体不一致率为3.24%。对基于HBeAg状态和病理状态分组的Bland-Altman一致性分析显示，血清HBV DNA(QIAGEN)与HBV DNA(COBAS)定量均具有较高一致性，HBeAg阳性和阴性患者的不一致率分别为3.70%和2.59%，不同病理状态的不一致率均<10.00%。根据ROC曲线分析，血清HBV DNA(QIAGEN)与HBV DNA(COBAS)预测HBeAg阳性和阴性患者相同病理状态的ROC曲线下面积之间的差异均无统计学意义。说明用于预测肝组织病理状态目的的血清HBV DNA(QIAGEN)与血清HBV DNA(COBAS)定量具有较高一致性。

HBeAg阳性患者，血清HBV DNA(QIAGEN)和HBV DNA(COBAS)用于预测肝组织病理学分级≥G3的最佳截断值分别为≤7.600 log10IU/mL和≤8.191 log10IU/mL，两者之差为-0.591 log10IU/mL，对应的灵敏度、特异度分别为0.795和0.886、0.500和0.508；用于预测病理学分期≥S4的最佳截断值分别为≤6.578 log10IU/mL和≤7.824 log10IU/mL，两者之差为-1.246 log10IU/mL，对应的灵敏度、特异度分别为0.654和1.000、0.735和0.581。HBeAg阴性患者，血清HBV DNA(QIAGEN)和HBV DNA(COBAS)用于预测肝组织病理学分级≥G2的最佳截断值分别为≥3.765 log10IU/mL和≥3.969 log10IU/mL，两者之差为-0.204 log10IU/mL，对应的灵敏度、特异度分别为0.970和0.909、0.614和0.651；用于预测病理学分期≥S2的最佳截断值分别为≥3.605 log10IU/mL和≥3.567 log10IU/mL，两者之差为0.038 log10IU/mL，对应的灵敏度、特异度分别为0.836和0.873、0.656和0.590。提示血清HBV DNA(QIAGEN)与HBV DNA(COBAS)预测HBeAg阴性患者肝组织病理学分级≥G2和分期≥S2性能的一致性高于其预测HBeAg阳性患者肝组织病理学分级≥G3和分期≥S4。

本文进一步评价了血清HBV DNA预测CHB患者肝组织病理状态的效能，同时比较了血清HBV DNA(QIAGEN)与HBV DNA(COBAS)预测CHB患者肝组织病理状态性能的一致性。结果显示，血清HBV DNA预测HBeAg阴性患者肝组织病理学分级≥G2的效能最大，血清HBV DNA(QIAGEN)与HBV DNA(COBAS)预测HBeAg阴性患者肝组织病理学分级≥G2的性能有较高一致性。

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(本文编辑：钱燕)

Performance comparison between QIAGEN real-time PCR and COBAS TaqMan for serum HBV DNA quantitation in predicting the pathological state of liver tissue from chronic hepatitis B patients

ZHANGZhan-qing,LUWei,WANGPing-an,WANGYan-bing,ZHOUXin-lan,DINGRong-rong,LIXiu-fen,HUANGDan.DivisionTwoofHepatitisDepartment,ShanghaiPublicHealthClinicalCenter,FudanUniversity,Shanghai201508,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate and compare the performance of QIAGEN real-time PCR and COBAS TaqMan for serum hepatitis B virus (HBV) DNA quantitation in predicting the pathological state of liver tissue from chronic hepatitis B patients. MethodsA total of 278 patients with chronic hepatitis B, including 162 HBeAg-positive and 116 HBeAg-negative ones, were enrolled in this study. Serum HBV DNA (QIAGEN) and HBV DNA (COBAS) were detected by real-time quantitative PCR and Roche TaqMan COBAS system, respectively. The Scheuer score system used for pathological diagnosis of liver tissue had 5 grades (G0-G4) and 5 stages (S0-S4), respectively. ResultsIn HBeAg-positive patients, there were statistically significant differences of serum HBV DNA (QIAGEN) and HBV DNA (COBAS) between G2 and G3, S1 and S4, S2 and S4, S3 and S4 (all P<0.05), respectively; in HBeAg-negative patients, there were statistically significant differences between G1 and G2, G1 and G3, S1 and S2, S1 and S3, S1 and S4 (all P<0.05), respectively. Rates of disagreement between serum HBV DNA (QIAGEN) and HBV DNA (COBAS) quantitation of G1-2, G3, S1-3 and S4 in HBeAg-positive patients were 4.24% (5/118), 9.09% (4/44), 3.68%(5/136) and 7.69%(2/26), respectively; and the rates of G1, G2-3, S1 and S2-4 in HBeAg-negative patients were 6.02% (5/83), 3.03% (1/33), 3.29% (2/61) and 3.64% (2/55), respectively. Areas under the receiver operating characteristic (ROC) curves of serum HBV DNA (QIAGEN) and serum HBV DNA (COBAS) for predicting ≥G3 and S4 in HBeAg-positive patients were 0.645 and 0.695, 0.703 and 0.755, respectively; and the areas for predicting ≥G2 and ≥S2 in HBeAg-negative patients were 0.848 and 0.817, 0.756 and 0.756, respectively. Optimal cut-offs of serum HBV DNA (QIAGEN) and serum HBV DNA (COBAS) for predicting S4 in HBeAg-positive patients were ≤3.784×106 IU/mL and ≤6.668×107 IU/mL, respectively; and the corresponding sensitivities and specificities were 0.654 and 1.000, 0.735 and 0.581, respectively; and the optimal cut-offs of serum HBV DNA (QIAGEN) and serum HBV DNA (COBAS) for predicting ≥G2 in HBeAg-negative patients were ≥5.821×103 IU/mL and 9.311×103 IU/mL, respectively; and the corresponding sensitivities and specificities were 0.970 and 0.909, 0.614 and 0.651, respectively. ConclusionThe most efficiency of serum HBV DNA for predicting the pathological state of liver tissue is characterized by predicting ≥G2 in HBeAg negative patients, and there is a high consistance of the performance between serum HBV DNA (QIAGEN) and serum HBV DNA (COBAS) for predicting ≥G2 in HBeAg negative patients.

【Key words】HBV DNA quantitation; QIAGEN reagent; Roche TaqMan COBAS system; Chronic hepatitis B; Liver tissue; Pathology

(收稿日期：2015-12-07)

Corresponding author:ZHANG Zhan-qing,Email: doctorzzqsphc@163.com

通信作者：张占卿，Email: doctorzzqsphc@163.com

基金项目：上海市卫计委重点科研项目(20134032)，国家“十二五”科技重大专项(2013ZX10002005)