手十二井穴放血对pMCAO大鼠脑组织血脑屏障通透性的影响

陈宇岑,王振国,陈泽林



手十二井穴放血对pMCAO大鼠脑组织血脑屏障通透性的影响

陈宇岑1,王振国2,陈泽林3

(1.天津中医药大学,天津 300193;2.西安中医脑病医院,西安 710068;3.天津中医药大学针灸推拿学院,天津300193)

目的 观察手十二井穴放血对永久大脑中动脉栓塞(Permanent Middle Cerebral Artery Occlusion,pMCAO)大鼠局灶性脑缺血损伤早期脑组织血脑屏障(Blood-brain Barrier,BBB)通透性的影响。方法 选用雄性Wistar大鼠,随机分为假手术组、模型组和放血组,用Longa法建立大脑中动脉栓塞模型后在5 h、24 h、72 h 3个时间点尾静脉注射2%伊文思蓝(Evans Blue,EB),通过测量提取脑组织中EB吸光度来评估EB的渗出量,以观察BBB的通透性。结果 模型组大鼠脑组织EB渗出量要显著高于假手术组(＜0.01),放血组大鼠的脑组织EB渗出量低于模型组(＜0.01)。结论 手十二井穴刺络放血可以降低pMCAO大鼠血脑屏障通透性,其效果在缺血后24 h和72 h均极为显著。

穴,井;手十二井穴;放血疗法;永久大脑中动脉栓塞;大鼠;血脑屏障通透性

脑血管病是中老年人最常见疾病之一,具有发病率高、致残致死率高、复发率高等特点,其中缺血性中风所占比例最大。从目前对中风病治疗措施的研究来看,大多注重后遗症的治疗,研究发现,及时有效的急救措施对于改善后遗症和减轻病死率具有重要的临床意义[1]。脑水肿是脑缺血后的重要病理生理改变,是中风病早期死亡的重要原因,其病理机制与脑组织血脑屏障(Blood-brain Barrier,BBB)结构和功能的改变密切相关。前期研究发现,大鼠伊文思蓝(Evans Blue, EB)在局灶性持续性脑缺血早期(0.5 h)即有渗出[2],本研究旨在观察作为急救之法的井穴放血法对于永久大脑中动脉栓塞(Permanent Middle Cerebral Artery Occlusion,pMCAO)大鼠早期脑组织血脑屏障通透性是否也有改善作用,为中医在缺血性脑血管病的中早期介入提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选用体重220～250 g健康雄性Wistar大鼠90只,清洁级,由天津中医药大学实验动物中心提供,随机分为9组,每组10只。室温保持在(22±2)℃,分笼饲养,自由饮水进食,常规适应性喂养1星期后进行实验,实验前禁食不禁水24 h。

1.2 实验仪器和试剂(见表1)

1.3 动物分组模型与制备

选用雄性Wistar大鼠,在SPSS16.0统计软件中生成随机数字表,将动物随机分为9组,即5 h假手术组、模型组、放血组,24 h假手术组、模型组、放血组,72 h假手术组、模型组和放血组。

动物模型制备方法参照Longa法[3],假手术组处理方法同模型组,只是插线过程中将鱼线插到颈动脉分叉处即可。放血组动物于清醒后进行评分,症状符合纳入标准即刻进行治疗。

模型纳入与剔除标准:大鼠麻醉清醒后进行神经功能评分,采用Zea-longa的分级标准在术后进行行为学评分,0分为无神经系统损害症状,活动正常;1分为对侧前肢不能完全伸直;2分为爬行时向左侧转圈;3分为行走时向左侧倾倒;4分为不能自发行走,意识丧失[3]。1分以下及3分以上剔除,并用同一批次的大鼠制成合格模型后补足数目。

放血组处理方法:用胶布处理毫针针尖,使其刺入皮肤深度限定在1 mm。用处理后的毫针于以下诸穴位点刺放血,出血量以血尽为止。取位于大鼠双侧前肢端的十二井穴。穴位定位方法采用比较解剖学,参考人体相应穴位解剖标志,在大鼠前肢各趾的相应部位选取。每日治疗1次。

表1 仪器试剂清单

1.4 标本采集及指标测定

各组动物在处死前1 h由尾静脉注射2%EB (4 mL/kg),可以明显地观察到大鼠的全身迅速变蓝。1 h后用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠,之后置于手术台,开胸,暴露心脏。从左心室灌注生理盐水以清除血管内EB,直到右心耳流出无色液体为止。迅速断头取脑,取蓝染侧脑组织皮质,称重,放入3 mL甲酰胺溶液中,54℃水浴箱中提取24 h,离心15 min (3000 r/min),取上清液在722分光光度计中测吸光度(波长为620 nm),甲酰胺作空白对照。

1.5 伊文思蓝标准曲线的建立及脑组织伊文思蓝含量的计算

1.5.1 伊文思蓝标准曲线的建立

伊文思蓝标准溶液制备:准确称取干燥的伊文思蓝10 mg,充分溶解于10 mL甲酰胺溶液中,伊文思蓝标准溶液浓度为1 mg/mL。

标准曲线绘制:准确吸取30mL伊文思蓝标准液(相当于伊文思蓝30mg),溶于6 mL甲酰胺溶液,充分混匀溶解,得到浓度为5mg/mL的伊文思蓝溶液6 mL,顺次以甲酰胺稀释,得到终浓度分别为5、2.5、1.25、0.625、0.313、0.156、0.078mg/mL的伊文思蓝溶液各3 mL。用722分光光度计在622 nm以甲酰胺溶液作为空白管参比,测定吸光度A值,以溶液浓度为横坐标,以溶液吸光度A值为纵坐标制作标准曲线,经直线回归后,得直线回归方程为Y=0.062X＋0.001, R2=0.999(见图1)。表明EB含量与EB吸光度密切相关。

1.5.2 伊文思蓝含量计算

脑组织伊文思蓝含量(mg/g湿脑)=A×甲酰胺量(mL)/脑组织湿重(g),其中A为根据标准曲线的回归方程求得的样本伊文思蓝含量(mg/mL)。

1.6 统计学方法

采用SPSS16.0统计软件进行数据分析,实验结果以均数±标准差表示,各组间比较采用单因素方差分析,＜0.05为有统计学意义。

2 结果

与假手术组相比,模型组EB渗出量在5 h、24 h、72 h都要高于同时间点的假手术组,有极显著统计学差异(＜0.01),表明造模后血脑屏障通透性显著增高,模型制备成功;EB在缺血后5 h即有明显渗出,之后逐渐增加,直到24 h,缺血后72 h EB渗出有所下降,但仍显著高于假手术组;各相同时间点的放血组与模型组相比,在5 h时,放血组与模型组相比差异无统计学意义(＞0.05);在24 h与72 h,放血组EB渗出量均低于模型组,有极显著统计学差异(＜0.01),提示放血组在24 h和72 h对于血脑屏障的通透性都有明显的改善作用(见表2、图2)。

表2 各组大鼠脑组织伊文思蓝渗出量 (±s,mg/g)

表2 各组大鼠脑组织伊文思蓝渗出量 (±s,mg/g)

组别n5 h24 h72 h 假手术组102.91±1.333.05±1.052.71±1.23 模型组106.11±1.681)9.56±1.711)5.72±1.381) 放血组105.67±1.471)5.12±1.542)3)3.80±1.383)

注:与同时间点假手术组比较1)＜0.01,2)＜0.05;与同时间点模型组比较3)＜0.01

3 讨论

十二井穴刺络放血法为中医传统的急救措施之一,古籍中多有记载。《素问·针解》:“菀陈则除之者,出恶血也。”《针灸大成》[4]:“凡中风跌倒,卒暴昏沉,……急以三棱针刺手十二井穴,当去恶血。”可见在明代以前,十二井穴放血疗法就已应用于临床治疗中风病。近年来,有不少针灸学家就井穴放血法治疗中风病的临床疗效作出了初步的临床研究和评价[5-8],但单纯运用井穴放血治疗中风的临床研究仍然较少,大多集中在井穴放血联合针刺、中西医药物等。

本课题组前期研究发现[9-10],井穴放血对pMCAO大鼠缺血后48 h、72 h脑水肿有一定改善作用,其疗效与甘露醇相当;井穴放血可以降低pMCAO大鼠缺血后48 h和72 h血脑屏障通透性,同时在电镜下观察发现,与模型组相比,井穴组血脑屏障超微结构的破坏程度在48 h和72 h均有所减轻。

本实验井穴放血法对模型大鼠24 h和72 h血脑屏障通透性均有所降低,其机理可能是该疗法能调节细胞外K﹢、Na﹢失衡,改变局部微循环血量,改变血液性状和血流速度,从而影响了血管通透性,调节了体液循环[11],促进脑血流的改善,缓解脑组织的缺血缺氧状况,使皮质缺血区的内环境发生良性改变[12]。

从中医学角度来讲,中风的病机总属阴阳失调、气血逆乱。《乾坤生意》:“以三棱针刺手指十二井穴,当去恶血,治一切暴死恶候,不省人事,及绞肠痧,乃起死回生妙诀。”井穴为十二经脉阴阳之气始发之处,罗天益在此基础上对中风病的治疗提出了大接经刺法[13-14],他认为中风病是由于经气不通、气血不畅、左右不能环周所致,而针刺位于四末的井穴可使十二经气相通,左右环周,不失为治疗偏枯证的有效疗法。中风的病位在脑,《灵枢·邪气藏府病形》:“十二经脉,三百六十五络,其血气皆上行于面而走空窍。”全身经脉可以通过头面空窍而与脑相联系,故井穴放血能通过调理十二经脉气血,进而改善脑的功能。

缺血性脑病的病理机制复杂,目前认为与能量耗竭、细胞内Ca2﹢超载、兴奋性氨基酸毒性、自由基损伤、血脑屏障受损等因素有关[15]。血脑屏障是机体维持中枢神经系统内环境稳定的结构基础,它的损害直接影响神经系统内环境的稳定,在缺血性中风发生发展过程中起着重要作用。本实验在一定程度上证实了手十二井穴放血对脑缺血中早期血脑屏障的通透性起到了调节作用,为针灸在缺血性脑病的中早期介入提供了一定的实验依据。而井穴放血是如何引起血脑屏障通透性的变化以及引起这种变化的潜在分子机制,还有待进一步研究。

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The Effect of Hand Twelve Jing-Well Points Bloodletting on Blood-brain Barrier Permeability in PMCAO Rats

1,2,3.

1.300193,; 2.710068,; 3.300193,

Objective To investigate the effect of hand twelve Jing-Well points bloodletting on blood-brain barrier (BBB) permeability in the early stage of focal cerebral ischemic injury in rats withpermanent middle cerebral artery occlusion (pMCAO). Method Male Wister rats were randomized into sham operation, model and bloodletting groups. A model of middle cerebral artery occlusion was made by Longa's method. 2% Evans blue (EB) was injected into the caudal vein at three time points: 5, 24 and 72 hrs after model making. EB exudation amount was assessed by measurement of EB absorbance in brain tissue to observe BBB permeability. Result Cerebral EB exudation amount was significantly higher in the model group of rats than in the sham operation group (＜0.01) and significantly lower in the bloodletting group than in the model group (＜0.01). Conclusion Hand twelve Jing-Well points bloodletting can reduce blood-brain barrier permeability in pMCAO rats. Its effect is highly significant at 24 and 72 hrs after ischemia.

Points, Jing-Well; Hand twelve Jing-Well points; Bloodletting therapy; Permanent middle cerebral artery occlusion; Rats; Blood-brain barrier permeability

1005-0957(2016)12-1466-03

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2016.12.1466

天津市科学技术委员会应用基础与前沿技术研究计划一般项目(14JCYBJC25800)

陈宇岑(1991 - ),女,2014级硕士生,Email:cycsy22@163. com

陈泽林(1966 - ),男,教授,博士,硕士生导师,Email:chenze lin328@163.com

2016-02-20