颅针对脑缺血再灌注损伤大鼠氧化应激的影响

黄玉栋,聂焱,王志强,郑雪峰



颅针对脑缺血再灌注损伤大鼠氧化应激的影响

黄玉栋1,聂焱2,王志强3,郑雪峰3

(1.福建莆田九五医院,莆田 351100;2.福建中医药大学附属福州市中医院,福州 350001;3.福建中医药大学针灸学院,福州 350122)

目的 观察颅针对脑缺血再灌注损伤大鼠脑梗死面积、血浆中SOD活性、MDA及NO含量的影响。方法 将SPF级SD雄性大鼠48只,随机分成假手术组、模型组及颅针组。采用线栓法制备大鼠脑中动脉缺血(MCAO)模型,采用Longa EZ神经功能评分方法评价大鼠神经功能,采用TTC染色的方法测定大鼠脑梗死面积,并采用比色法检测血浆中超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)及一氧化氮(NO)的含量。结果 与假手术组相比,在第1、3、7天模型组大鼠的神经行为学评分均显著降低(＜0.01)。经TTC检测发现颅针组脑梗死体积显著小于模型组。同时与假手术组相比,模型组大鼠血浆SOD活性降低(＜0.01),MDA和NO含量升高(＜0.01);与模型组比较,颅针治疗后,血浆SOD活性升高(＜0.01),MDA、NO含量降低(＜0.01)。结论 颅针对大鼠脑缺血再灌注损伤具有保护作用,能提高脑缺血再灌注损伤大鼠血浆SOD活性,降低血浆MDA、NO含量。

电针;卒中;缺血再灌注损伤;氧化应激;大鼠;头针;颅针

随着世界人口老龄化的加剧,脑卒中成为了世界上高致残率、高死亡率、高发病率的一种疾病,给人类健康造成了巨大的威胁[1-3]。其中缺血性脑卒中已成为社会和医学界关注的公共健康问题。长期以来,人们一直在探索治疗脑卒中的有效方法,但迄今为止,尚未找到公认、安全、有效的治疗方法。国内外目前普遍认为发病3 h的溶栓治疗是治疗缺血性脑卒中最有效的治疗方法,但由于溶栓要求严格的时间窗,且需严格控制适应证,只有少数的患者有机会进行这一治疗。因此,寻找安全有效的治疗缺血性脑卒中的手段,在挽救患者生命的同时,也尽可能减轻缺血带来的神经功能的损伤,改善患者生活、生命质量,使其早日恢复功能,也越来越受到重视。

颅针是福建中医药大学针灸学院俞昌德教授根据中医学经络腧穴理论结合现代医学颅骨解剖的特殊结构——颅骨缝,并在长期不断的临床实践中探索出来的一种以骨缝取穴的创新头针方法[4-5]。前期的临床研究[6-7]表明,针刺急性脑梗死患者的颅骨缝区,能明显改善患者临床症状,特别是在急性期介入颅针,对后期的神经功能恢复有明显的差异,但其具体的作用机制尚不明确。为了进一步明确颅针对脑缺血再灌注损伤的作用机理,本研究通过观察针刺对脑缺血再灌注损伤大鼠血液中超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)及一氧化氮(NO)含量的影响,探讨针刺治疗缺血性脑卒中可能的作用机理,为脑卒中的针灸康复治疗提供一定的实验依据及新的临床治疗方法。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

SPF级SD大鼠,雄性,48只,体重240～280 g,由福建中医药大学实验动物中心提供,同时福建中医药大学实验动物中心提供SPF级医学实验动物环境设施,使用许可证号为SYXK(闽)2009-0001。实验动物中心饲养条件为①SPF级实验室;②标准饲料及灭菌洁净水;③室温(25±2)℃,相对湿度55%～70%;④自由摄食饮水;⑤每日定时更换垫料,保持干燥;⑥维持12 h光照,昼夜循环。48只SPF级SD大鼠随机分为3组,即假手术组16只,缺血再灌注模型组16只,颅针针刺组16只。各组中8只用于脑梗死面积测定,另外8只用于血浆中SOD活性及MDA及NO含量的测定。

1.2 主要材料、试剂和仪器

0.35 mm×13 mm毫针(苏州医疗器械厂);NO、SOD、MDA试剂盒(南京建成生物工程研究所);ELX-800多功能酶标仪(中国Tecan公司);低速离心机(上海仪分科学仪器有限公司)。

1.3 模型制备

参照Longa EZ等[8]线栓法建立大鼠脑中动脉闭塞(MCAO)模型。大鼠腹腔注射10%水合氯醛(30 mg/ 100 g体重),麻醉后仰卧固定于手术台上,取颈正中切口,分离出左颈总动脉(common carotid artey,CCA)、颈内动脉(internal carotid artey,ICA)及颈外动脉(external carotid artey,ECA),结扎ECA、CCA,用动脉夹夹闭ICA后,在ECA作一切口,从切口处插入硅胶包被的尼龙线,经CCA分叉处,稍稍结扎CCA分叉的插线处,然后撤掉ICA远端的动脉夹,将硅胶包被的尼龙线顺势缓缓送入,越过翼腭动脉直至颅内大脑前动脉的近端,深度约18～20 mm时停止插线,实现大脑中动脉阻塞导致脑缺血。硅胶包被的尼龙线外留约1 cm,缝合皮肤。2 h后轻轻提拉所留线头至有阻力,实现大脑中动脉再灌。假手术组只分离动脉,不结扎、插线。造模后4 h根据Longa EZ神经功能评分方法对造模大鼠进行评分,以判断造模是否成功,其中,0分及4分者被剔除,取评分1～3分的大鼠进行后续实验。本实验中造模大鼠评分均是2分或3分。

1.4 干预措施

颅针组取穴根据杨安峰《大鼠的解剖和组织》及林文注所介绍的动物穴位定位方法[9-10],即矢状缝头皮线(大鼠两耳间连线的中点作一垂直线,截取鼻翼骨上缘至两耳后缘间的距离)、冠状缝头皮线(大鼠两侧颧弓的后缘点作一弧线,截取两侧额嵴间的距离)、人字缝头皮线(大鼠两耳后缘之间作一弧线,截取两侧鼓骨上嵴的距离)。采用0.35 mm×13 mm毫针沿各颅骨缝头皮线成15°角针刺,针刺后施以电针(电流0.3 mA,疏密波,疏波频率20 Hz,密波频率100 Hz),以大鼠出现头部轻度抖动为度,留针30 min,每日1次。手术后24 h开始治疗,共7 d。假手术组及模型组同样抓取,不做其他任何处理。

1.5 观察指标

1.5.1 大鼠神经行为学评价

按Longa EZ神经功能评分方法进行神经功能缺损评分,评分表如表1。分值越高,损伤越严重。

表1 Longa EZ神经功能评分方法

1.5.2 TTC法测定脑梗死面积

实验结束后,取其中8只大鼠腹腔注射麻醉,腹腔注射麻醉后大鼠断头取脑,去掉嗅球、小脑和低位脑干,剩余部分在﹣20℃冰箱冷冻10 min,在冰盘上冠状切成6片,迅速将脑片置于TTC染液中,37℃避光温孵1 h,经染色后非缺血区为玫瑰红色,梗死区为白色。用软件计算脑梗死面积占半脑面积的百分比。

1.5.3 血浆中SOD活性及MDA、NO含量的测定

实验结束后,另取其中8只大鼠腹腔注射麻醉,于大鼠腹主动脉取血,血液置于含肝素钠的采血管中,室温静置2 h后,4℃ 3000 r/min离心l0 min,分离血浆,根据NO、SOD、MDA试剂盒说明书,测定样品中的SOD活力及MDA、NO的含量。

1.6 统计学方法

实验数据采用SPSS20.0统计软件进行处理,数据采用均数±标准差表示,组间比较采用方差分析,＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 3组大鼠神经功能缺损评分比较

分别在造模后的第1、3、7天进行大鼠神经行为学评价,各组大鼠神经行为学评分见表2。结果显示,在第1、3、7天模型组大鼠的神经功能症状评分显著高于假手术组(＜0.01,＜0.05),说明脑缺血再灌注可造成明显的神经功能缺损;颅针组在第1、3天的神经功能症状评分均小于模型组,但没有统计学差异(＞0.05),而第7天评分低于模型组,且有统计学差异(＜0.05),说明颅针之后能够提高大鼠的神经功能,提示颅针对模型大鼠的神经功能损伤具有改善作用。

表2 3组大鼠神经功能缺损评分比较 (±s,分)

表2 3组大鼠神经功能缺损评分比较 (±s,分)

组别n第1天第3天第7天 假手术组80.00±0.000.00±0.000.00±0.00 模型组82.78±0.932)2.75±0.892)2.11±0.001) 颅针组82.67±0.872.35±0.691.67±0.523)

注:与假手术组比较1)＜0.05,2)＜0.01;与模型组比较3)＜0.05

2.2 3组大鼠脑梗死面积比较

采用TTC染色的方法测定脑梗死的面积,结果如图1所示。假手术组脑片染成均匀红色,无梗死灶,模型组大鼠损伤侧大脑出现明显的梗死灶,而颅针组能缩小脑梗死范围。以设假手术组梗死面积百分比为0作为对照,经统计分析模型组脑梗死面积占(30.5±3.1)%,颅针组脑梗死面积占(21.3±2.0)%,模型组与颅针组比较有显著性差异(＜0.05)。详见图2。

图1 脑梗死组织切片图

注:与假手术组比较1)P＜0.01;与模型组比较2)P＜0.05

2.3 3组大鼠血浆中NO、SOD、MDA比较

如表3所示,与假手术组相比,模型组大鼠血浆SOD活性降低(＜0.01),MDA和NO含量升高(＜0.01);与模型组比较,颅针治疗后,血浆SOD活性升高(＜0.01),MDA、NO含量降低(＜0.01)。

表3 3组大鼠血浆中NO、SOD、MDA的比较 (±s)

表3 3组大鼠血浆中NO、SOD、MDA的比较 (±s)

组别nNO(mmol/L)SOD(U/mL)MDA(nmol/mL) 假手术组819.15±3.37136.94±22.056.72±1.05 模型组835.31±7.031)75.11±5.011)12.39±2.431) 颅针组825.04±5.102)113.76±15.652)7.11±1.742)

注:与假手术组比较1)＜0.01;与模型组比较2)＜0.01

3 讨论

缺血性脑卒中是由于脑部血流量减少引起的大脑缺血缺氧损伤。药物疗法和机械再灌注治疗,尤其是抗血栓类药物的使用已经成为缺血性脑卒中急性阶段的有效治疗方法。但是,由于其治疗时间窗较短,易引起颅内出血等不良反应,仅有少数患者适用该种治疗。因此,缺血性脑卒中患者除了极少数可恢复外,约3/4患者会留下轻重程度不一的后遗症——神经功能缺损,同时缺血性脑卒中溶栓后,过度灌注可加重脑水肿、颅内高压、神经功能损伤的症状。脑卒中后的神经功能缺损症状,如口眼歪斜,半身不遂,思维缓慢,甚至情绪抑郁等,是脑卒中后存活患者所遗留的最主要问题,不仅严重影响患者的日常生活质量,同时漫长的病程及高额的治疗费用,严重影响患者生活质量,给社会和家庭造成严重的负担[11-13]。因此,寻找安全有效的治疗缺血性脑卒中的手段,在挽救患者生命的同时,也尽量减轻缺血带来的神经损伤,改善患者生活、生命质量,使其早日恢复功能,是脑缺血中风治疗研究中的重点。

福建中医药大学俞昌德教授在长期的中医针灸临床实践中探索出一种治疗脑血管疾病的新型头针疗法——颅针疗法。俞氏颅针是以现代颅骨解剖结构为基础,以中医经络腧穴理论为指导的头针疗法。其中,颅骨由顶骨、额骨、颞骨、枕骨等多块颅骨组成,各个颅骨毗邻骨缘间由致密的结缔组织而形成颅骨缝。颅骨缝间有导血管构成内外的通道,且与颅神经、部分相伴的动静脉血管及神经感受器构成错综交杂的解剖结构网络。另有研究发现[14],在每侧颅骨的密集区域,脑膜中动脉穿过颅骨内板的细小分支成为了颅骨的滋养动脉,共同构成颅针治疗脑血管疾病及后遗症的解剖学基础。

衡量脑缺血再灌注损伤的程度可以通过神经功能缺损评分和脑梗死面积的大小而定。本实验研究发现针刺脑缺血再灌注损伤大鼠矢状缝头皮线、冠状缝头皮线、人字缝头皮线后,能够减小大鼠脑梗死部位面积,改善大鼠神经功能缺损症状评分,从而减轻大鼠脑缺血再灌注后的损伤,说明颅针对脑缺血再灌注损伤具有一定的保护作用。

脑卒中发生的一个重要因素就是氧化应激。许多研究证实,脑缺血再灌注损伤发生过程中,活性氧大量聚集,最终引发氧自由基损伤[15-16]。在生理状况下,细胞在呼吸过程中会产生一定量的自由基,但这些自由基会很快地被体内的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)等酶类及时分解,因此并不会对机体造成损伤。但在病理情况下(脑缺血再灌注损伤时),由于细胞新陈代谢发生改变,产生大量氧自由基,超出了细胞内各种酶的代谢,生物膜的不饱和脂肪酸受氧自由基攻击,使细胞膜发生脂质过氧化损伤,导致细胞的死亡或凋亡通路被过度激活,造成不可逆的损伤。有文献报道,缺血再灌注后脑内自由基显著增加,增加的自由基可能来源于线粒体功能受损后呼吸链、胞质中NADPH进入线粒体后的氧化等[17-19],因此抗自由基治疗是早期脑保护的重要途径之一。

SOD和MDA是反映自由基损伤的指标。SOD属于细胞内源性的抗氧化酶类,在机体的氧化平衡中扮演着重要角色。SOD能清除超氧阴离子自由基,保护细胞抵抗氧化损伤,其活性的强弱反应了细胞的抗氧化能力,能间接反映细胞的受损程度。MDA是细胞膜脂质过氧化指标。自由基能作用于脂质发生过氧化反应,生成MDA,与蛋白质、核酸等生命大分子交联聚合,影响线粒体内关键酶的活性,对细胞产生一定的毒性作用。目前,针对氧化应激的干预措施及药物研究较多[20-22],但随着世界老年人口的增多、人民生活水平的提高,预计脑卒中的发病率在我国还会继续上升,中医治疗中风有着悠久的历史,积累了丰富的理论知识和临床经验,特别是针灸疗法,是一种常见而有效的治疗缺血性中风方法,临床有关报道颇多[23-26]。

本实验结果显示,大鼠在脑缺血再灌注后,血浆MDA含量升高,血浆SOD活性降低;颅针干预后,可明显升高SOD活性,而MDA含量明显降低。提示颅针对脑缺血再灌注损伤的保护机制与提高机体抗氧化能力,从而减轻由氧自由基介导的脂质过氧化反应,抑制缺血再灌注后氧化应激有关。本实验研究证实了颅针对脑缺血再灌注损伤具有一定的保护作用,初步探讨了其可能的作用机制是通过调节氧化应激途径实现其保护作用,更深入具体的作用机制还有待于进一步的研究。

[1] 王维治.神经病学[M].北京:人民卫生出版社,2005:135.

[2] 赵娟,李彬.脑卒中危险因素的预防[J].中国社区医师:医学专业,2004,6(22):91-92.

[3] 姜嘟嘟,柳毅刚,詹青.中青年急性重症脑卒中死亡原因探讨[J].神经病学与神经康复学杂志,2011,8(3):141-142.

[4] 王国书,李昌生,赖秀娟,等.颅针配合康复训练治疗偏瘫临床观察[J].上海针灸杂志,2013,32(4):258-259.

[5] 俞昌德,王国书,吴炳煌,等.颅针加药物对急性脑梗死痰证患者神经功能康复与血清SOD、MDA影响的研究[J].福建中医学院学报,2010,20(2):7-9.

[6] 俞昌德,吴炳煌,陈旭军.头针刺对急性脑梗死患者神经功能改善及外周血管内皮素的影响[J].中国临床康复,2002,6(3):434- 435.

[7] 俞昌德,吴炳煌,白靖宇,等.针刺颅骨缝加药物治疗急性脑梗死患者的临床研究[J].中国针灸,2004,24(5):329-332.

[8] Longa EZ, Weinstein PR, Carlson S,. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J]., 1989,20(1): 84-91.

[9] 杨安峰,王平.大鼠的解剖和组织[M].北京:科学出版社,1985:6.

[10] 林文注,王佩.实验针灸学[M].上海:上海科学技术出版社,1994: 1.

[11] Donnan GA, Fisher M, Macleod M,. Stroke[J]., 2008,371(6):1612-1623.

[12] Hong KS, Saver JL. Quantifying the value of stroke disability out- comes: WHO global burden of disease project disability weights for each level of the modified Rankin Scale[J]., 2009,40(12):3828-3833.

[13] Coyle D, Coyle K, Cameron C,. Cost-effectiveness of new oral anticoagulants compared with warfarin in preventing stroke and other cardiovascular events in patients with atrial fibrillation[J]., 2013,16(4):498-506.

[14] 俞昌德,吴炳煌,陈跃,等.针刺颅骨缝治疗脑血管疾病的应用解剖[J].中国针灸,2002,22(3):177-179.

[15] Murphy TH, Miyamoto M, Sastre A,. Glutamate toxicity in a neuronal cell line involves inhibition of cystine transport leading to oxidative stress[J]., 1989,2(6):1547-1558.

[16] Froissard P, Duval D. Cytotoxic effects of glutamic acid on PC12 cells[J]., 1994,24(24):485-493.

[17] Adibhatla RM, Hatcher JF. Lipid oxidation and peroxidation in CNS health and disease: from molecular mechanisms to therapeutic opportunities[J]., 2010,12(1):125-169.

[18] Kahles T, Brandes RP. NADPH oxidases as therapeutic targets in ischemic stroke[J]., 2012,69(14):2345-2363.

[19] 王四海,郭桢,张秀敏,等.清除自由基对脑缺血损伤的保护作用[J].河北北方学院学报(自然科学版),2014,30(5):107-109.

[20] Liu P, Zhao H, Wang R,. MicroRNA-424 protects against focal cerebral ischemia and reperfusion injury in mice by suppressing oxidative stress[J]., 2015,46(2):513-519.

[21] Oztanir MN, Ciftci O, Cetin A,. The beneficial effects of 18b-glycyrrhetinic acid following oxidative and neuronal damage in brain tissue caused by global cerebral ischemia/reperfusion in a C57BL/J6 mouse model[J]., 2014,35(8):1221-1228.

[22] Jing X, Ren D, Wei X,. Eriodictyol-7-O-glucoside activates Nrf2 and protects against cerebral ischemic injury[J]., 2013,273(3):672-679.

[23] 李继英,赵杨,张臻年,等.通脑活络针刺疗法对急性脑梗死患者BI、NIHSS评分的影响[J].中国中西医结合杂志,2011,31(1):28-32.

[24] 黄锦才.针刺改善缺血性脑卒中患者日常生活能力与认知功能作用研究[J].亚太传统医药,2014,10(21):697-698.

[25] 韩誉功.针灸治疗缺血性中风临床效果分析[J].中国实用医药,2013,8(31):233-234.

[26] 徐世芬,徐占英.近十年针灸治疗缺血性中风临床研究进展[J].新疆中医药,2002,20(2):53-57.

The Effect of Skull Acupuncture on Oxidative Stress in Rats with Cerebral Ischemia/Reperfusion Injury

1,2,3,3.

1.351100,; 2.350001,; 3.350122,

Objective To investigate the effect of skull acupuncture on cerebral infarct volume and plasma SOD activity and MDA and NO contents. Method Forty-eight male SPF-grade SD rats were randomized into sham operation, model and skull acupuncture groups. A rat model of middle cerebral artery occlusion (MCAO) was made by intraluminal thread occlusion. Rat nerve function was assessed by Zea Longa neurological function scoring. Rat cerebral infarct volume was measured by TTC staining. Plasma superoxide dismutase (SOD) activity and malondialdehyde (MDA) and nitric oxide (NO) contents were measured by colorimetry. Result Rat neurobehavioral score was significantly lower on day 1, 3 and 7 in the model group than in the sham operation group (＜0.01). TTC measurement showed that cerebral infarct volume was significantly smaller in the skull acupuncture group than in the model group (＜0.01). Plasma SOD activity was lower and MDA and NO contents were higher in the model group than in the sham operation group (all＜0.01). Plasma SOD activity increased and MDA and NO contents decreased after skull acupuncture treatment compared with the model group (all＜0.01). Conclusion Skull acupuncture has a protective effect against cerebral ischemia/reperfusion injury and can increase plasma SOD activity and decrease plasma MDA and NO contents in rats with cerebral ischemia/reperfusion injury.

Electroacupuncture; Stroke; Cerebral ischemia/reperfusion injury; Oxidative stress; Rats;Head acupuncture Skull acupuncture

1005-0957(2016)12-1473-04

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2016.12.1473

福建省教育厅B类课题(JB09127)

黄玉栋(1976 - ),男,主治医师, Email:1013012570@qq. com

郑雪峰(1979 - ),男,副教授,博士,Email:drzxf01@163.com

2016-04-25