艾条悬灸肾俞、关元对肾阳虚大鼠垂体-肾上腺轴和垂体-甲状腺轴的影响

闵友江,姚海华,程立红



艾条悬灸肾俞、关元对肾阳虚大鼠垂体-肾上腺轴和垂体-甲状腺轴的影响

闵友江,姚海华,程立红

(江西中医药大学附属医院,南昌 330006)

目的 观察艾条悬灸对肾阳虚大鼠垂体-肾上腺轴和垂体-甲状腺轴的影响。方法 以氢化可的松肌肉注射制作皮质酮肾阳虚动物模型,将大鼠随机分成模型对照组、艾灸治疗组,并设立空白对照组,艾灸治疗组采用艾条悬灸肾俞、关元,每次每穴20 min,每日1次,共治疗14次;治疗结束后采用ELISA方法检测各组大鼠血清CORT、ACTH、T3、T4、TSH的含量,采用RT-PCR方法检测垂体ACTH、TSH mRNA的表达。结果 与模型对照组比较,艾灸治疗组血清CORT无显著性差异(＞0.05),血清ACTH、T4、TSH和垂体ACTH、TSH mRNA均具有显著性差异(＜0.05),血清T3具有极显著性差异(＜0.01);与空白对照组比较,艾灸治疗组上述各指标均无显著性差异(＞0.05)。结论 艾条悬灸肾俞、关元通过降低血清TSH的含量,下调垂体TSH mRNA的表达和升高血清ACTH、T3、T4的含量,上调垂体ACTH mRNA的表达对肾阳虚大鼠起治疗作用。

艾条灸;肾阳虚;垂体-肾上腺轴;垂体-甲状腺轴;大鼠

艾灸因具有温经散寒、温肾助阳、升阳固脱等作用而广泛应用于临床,有报道显示艾灸治疗肾阳虚型女性性功能障碍和男子精子活力低下等疾病取得了良好疗效[1-5]。为进一步研究艾灸治疗肾阳虚证的机制,本实验以氢化可的松肌肉注射制作皮质酮肾阳虚模型大鼠为研究对象,观察艾条悬灸肾俞、关元对肾阳虚模型大鼠血清CORT、ACTH、T3、T4、TSH含量和垂体ACTH、TSH mRNA表达的影响,现将研究内容报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物

24只SD雄性大鼠,体重(220±20)g,由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供,合格证号为SCXK (湘)2011-0003,清洁级,标准配方杆状饲料喂养,自由进水。所有大鼠适应性饲养3 d后开始实验。

1.2 实验器材

酶标仪(芬兰Labsystems Multiskan MS公司);洗板机(芬兰Thermo Labsystems公司);移液器(吉尔森P型移液器Pipetman);旋涡振荡器(上海青浦泸西仪器厂);低温冷冻离心机[Sigma(3K15)公司];Real-time检测仪[ABI(ABI-7300)公司];艾条(江西中医药大学附属医院特制,直径4 mm,长度12 mm)。

1.3 实验试剂

氢化可的松注射液(天津金耀氨基酸有限公司,规格含量为5 mL/25 mg,批准文号为国药准字H12020886); CORT、ACTH和T3、T4、TSH酶联免疫检测试剂盒(上海博谷生物科技有限公司);Trizol(Nvitrogen公司); SYBR Green PCR试剂盒、逆转录试剂盒(Thermo公司); RNaseⅠ(Fermentas公司)。

1.4 造模

参照文献[6]制作动物模型,每只大鼠按照0.03 mg/g·bw剂量肌注氢化可的松,每日1次,连续10 d。并采取自然光照、自由进食及饮水。模型成功判断标准为造模的大鼠体重减轻、毛发失去光泽、弓背、扎堆、反应迟钝、活动减少、阴囊皱缩、尿量明显增多。

1.5 处理方法

在确认模型成功的基础上,将模型大鼠按照信封随机法分为两组,每组8只,另外设立空白对照组8只。共3组。艾灸治疗组穴位定位根据《实验针灸学》[7]取关元、肾俞(双);从第11天起开始艾灸治疗。治疗前预先剪去穴位处的毛发,用江西中医药大学附属医院特制的艾条悬于关元、肾俞穴上,先回旋灸2 min预热局部皮肤,再固定于上述穴位施行温和灸,实施者将食指放于穴位附近,以有温热感为宜。艾条悬灸20 min,每日1次,7次为1个疗程,疗程间隔休息2 d,再进行第2个疗程,共治疗14次。模型对照组进行与艾灸治疗组相同的固定。空白对照组在其他两组大鼠造模时根据体重注射相应剂量的生理盐水,进行与艾灸治疗组相同的固定。

1.6 指标检测及方法

1.6.1 标本采集

治疗结束第2天处死大鼠。抽取动脉血,离心,取上清液,分装,﹣20℃冰箱保存备用。断头,咬骨钳去颅骨,分离垂体组织,液氮中速冻,﹣80℃冰箱保存备用。

1.6.2 血清CORT、ACTH和T3、T4、TSH含量的检测

采用ELISA方法,按照试剂盒说明书进行操作。

1.6.3 垂体ACTH和TSH mRNA表达的检测

采用RT-PCR方法。组织总RNA的抽提按Trizol说明书操作。总RNA中DNA的消除、反转录、Real-time PCR扩增、相对mRNA表达水平的计算等操作及方法参考文献[8]。引物的合成与纯化均由上海捷瑞生物科技有限公司提供。ACTH上游引物序列为5'-GCAAAGAACGAAGTCCGTGA-3',下游引物序列为5'-GATGGTGCTTGCTGTTGACC-3'。TSH上游引物序列为5'-AGTGGCTATACGGAGCCAGA-3',下游引物序列为5'-TGTTAGTGTGGTGTGAGCCC-3'。GAPDH上游引物序列为5’-GCAAGTTCAACGGCACAG-3’,下游引物为5’-GCCAGTAGACTCCACGACAT-3’。

1.7 统计学方法

所有实验数据以均数±标准差表示。采用SPSS16.0统计软件进行统计分析,以＜0.05作为差异有统计意义。组间比较采用单因素方差分析,方差齐采用多重比较,方差不齐采用’3多重比较。

2 结果

2.1 一般情况观察

造模大鼠体重减轻,毛发失去光泽,弓背,扎堆,反应迟钝,活动减少,阴囊皱缩,尿量明显增多;经艾灸治疗后,大鼠食欲增加,体重加重,活动增加,毛发渐有光泽,而模型对照组大鼠体重未见显著变化,毛发欠光泽,仍弓背、反应迟钝、活动减少,喜扎堆,阴囊皱缩,尿量较多。

2.2 各组血清CORT、ACTH含量和垂体ACTH mRNA表达的变化

空白对照组与模型对照组之间比较,血清CORT无显著性差异(＞0.05),血清ACTH和垂体ACTH mRNA均具有极显著性差异(＜0.01);艾灸治疗组与模型对照组比较,血清CORT无显著性差异(＞0.05),血清ACTH和垂体ACTH mRNA均具有显著性差异(＜0.05);艾灸治疗组与空白对照组比较,上述各指标均无显著性差异(＞0.05)。统计结果见表1。

表1 各组大鼠血清CORT、ACTH含量和垂体ACTH mRNA表达的比较 (±s)

表1 各组大鼠血清CORT、ACTH含量和垂体ACTH mRNA表达的比较 (±s)

组别n血清CORT(nmol/L)血清ACTH(pg/mL)垂体ACTH mRNA 模型对照组8108.40±13.4020.93±1.172.78±0.50 艾灸治疗组8108.05±14.5122.38±2.412)3.17±0.302) 空白对照组8111.10±20.4025.25±2.531)3.74±0.381) F―0.0946.41511.504 P―0.9110.010 0.000

注:与模型对照组比较1)＜0.01,2)＜0.05

2.3 各组血清T3、T4、TSH含量和垂体TSH mRNA表达的变化

空白对照组与模型对照组之间比较,血清T3、T4、TSH和垂体TSH mRNA均具有极显著性差异(＜0.01)。艾灸治疗组与模型对照组比较血清T3均具有极显著性差异(＜0.01),血清T4、TSH和垂体TSH mRNA均具有显著性差异(＜0.05);艾灸治疗组与空白对照组比较,上述各指标均无显著性差异(＞0.05)。统计结果见表2。

表2 各组大鼠血清T3、T4、TSH含量和垂体TSH mRNA表达的比较 (±s)

表2 各组大鼠血清T3、T4、TSH含量和垂体TSH mRNA表达的比较 (±s)

组别n血清T3(ng/mL)血清T4(nmol/mL)血清TSH(pg/mL)垂体TSH mRNA 模型对照组8161.12±32.22122.56±18.3383.49±6.965.43±1.34 艾灸治疗组8197.43±17.861)157.30±22.732)72.04±11.882)3.68±1.292) 空白对照组8211.66±18.901)178.13±12.631)64.10±6.851)2.62±1.231) F―9.50618.6789.6479.736 P―0.001 0.0000.0010.001

注:与模型对照组比较1)＜0.01,2)＜0.05

3 讨论

临床长期大量使用肾上腺皮质激素治疗的患者停药后表现为肾上腺皮质功能低下,出现肾阳虚一系列症状。沈自尹院士[9]几十年来的研究证实肾阳虚证的物质基础在于下丘脑-垂体-靶腺轴的功能低下。下丘脑分泌激素(CRH、ACTH)作用于腺垂体,通过腺垂体调控靶腺(肾上腺、甲状腺)CORT和T3、T4的分泌,这些靶腺分泌的激素又可反馈作用于其上级中枢,调节上级激素(ACTH、TSH)的释放。近年来,有多位研究者[10-14]采用氢化可的松制作皮质酮肾阳虚证动物模型,并采用中药复方(如右归丸、肾气丸)或单体(如淫羊藿总黄酮、山茱萸提取物等)来治疗肾阳虚大鼠,研究发现这些中药复方或单体均能使低下的下丘脑-垂体-靶腺轴功能有一定程度的恢复。蒋淑君等[10]发现大剂量的山茱萸提取物能使肾阳虚大鼠含量低下的下丘脑CRH升高;陈津岩等[11]研究证实服用右归丸后肾阳虚大鼠含量低下的ACTH和CORT显著上升,下丘脑CRH含量也有所上升;许兰芝等[13]发现淫羊藿总黄酮能使皮质酮肾阳虚大鼠血清中低下的T4、T3含量显著升高;马娜等[14]采用右归丸治疗肾阳虚大鼠,发现右归丸组各期的垂体-甲状腺轴激素水平较模型组均有明显升高,且都有统计学差异。也有研究者[15]发现艾灸肾俞、关元能明显升高肾阳虚大鼠血清中低下的CORT、ACTH含量。

肾阳虚证模型是中医虚证实验研究中运用得最多且比较成功的动物模型之一。该动物模型是依据临床肾阳虚患者肾上腺皮质功能低下而设计的。按照陈英华等[16]提出的评价肾阳虚动物模型从一般状态与实验检测、客观指标、药物反证几个方面进行评价的科学设想,本课题前期研究[6,8,17]采用氢化可的松肌肉注射制作肾阳虚证实验动物模型,通过对大鼠进行一般情况观察、右归丸治疗反证,模型组血清CRH、T3、T4、血清睾酮、垂体ACTH水平及其mRNA的表达分别明显低于正常对照组和右归丸治疗组,表明模型是成功的。

本实验研究中,除血清CORT外,模型对照组中大鼠血清ACTH、T3、T4、TSH的含量和垂体ACTH、TSH mRNA的表达较正常大鼠发生异常,配合对大鼠一般情况的观察,间接表明模型是成功的;经艾条悬灸肾俞、关元穴后,艾灸组大鼠血清T3的含量较模型组有极显著的升高(＜0.01),血清ACTH、T4的含量和垂体ACTH mRNA的表达都有显著的升高(＜0.05),而血清TSH的含量和垂体TSH mRNA的表达则较模型组有显著下降(＜0.05)。中医学认为,艾灸具有温经散寒、温肾助阳、升阳固脱作用;肾俞以补阳为主[18-19],关元以补气为主[20-21],二穴相伍,同走下焦,培补元气,补肾温阳之功更佳[15]。肾俞穴属膀胱经,是肾的背俞穴;而膀胱与肾相表里。穴名释义曰:肾俞,应肾,是肾气转输,输注之穴,是治肾重要腧穴,故名肾俞。《医宗金鉴》:“肾俞,主治下元诸虚,精冷无子……”关元穴属任脉,是小肠的募穴,足三阴经、任脉交会穴。穴在脐下3寸,为人身元阴元阳关藏之地,故名关元;是治疗诸虚百损之常用穴[22-23],肾虚所致男科病、妇科病之要穴。《扁鹊心书》记载:“每夏秋之交,即灼关元千炷,久久不畏寒暑……令人长生不老。”现代医学研究表明,肾俞穴区的组织受第1～3腰神经节段支配,第1～3腰神经前支参与腰丛的组成,从腰丛发出髂腹股沟神经和生殖股神经支配生殖器;肾俞穴所在的腰部4对腰神经节连成腰交感干,腰交感干通过交通支与腰神经相连并随腰神经分布;腰交感干通过腰内脏神经与腹盆部的脏器如肾、肾上腺、内生殖器等联系。这可能就是经穴-脏腑相关学说和背俞穴治疗相应脏腑疾病的物质基础之一。关元穴浅层主要有十二胸神经前支的前皮支和腹壁浅动、静脉的分支或属支,深层有十二胸神经前支的分支;通过交通支,腰交感干神经节与相应的脊神经相连;其中,内脏小神经,由穿过第10～12胸交感干神经节的节前纤维组成,下行穿过膈脚,主要终于主动脉肾节(属于内脏神经丛中的腹腔丛);由腹腔节、主动脉肾节等发出的节后纤维,分布至肝、脾、肾等实质性脏器和结肠左曲以上的消化管。周金山等[24]采用HRP神经束路追踪技术研究发现关元和子宫的传入神经在腰3到骶5之间的脊神经节内有汇聚与重叠。赵琛等[25]研究发现温和灸肾俞穴、关元穴能明显改善肾阳虚老年人腰膝酸软、畏寒肢冷、夜尿频等症状,并能显著降低外周血单个核细胞Rb蛋白阳性表达率。赵伟康等[26]研究发现艾灸关元穴能明显提高老年大鼠降低的大脑皮层NE、下丘脑TRH,血清T4和脾脏IL-2活性,降低老年大鼠升高的血清TRH,由此认为艾灸关元穴能不同程度调整神经内分泌和免疫系统,从而达到补肾固本,延缓衰老作用。任大蔚等[15]筛选肾俞、足三里、关元3个穴位两两组合的最佳配伍时以血清CORT、ACTH为观测指标,发现温和灸肾俞、关元治疗肾阳虚大鼠的疗效要好于灸肾俞、足三里与灸关元、足三里。

本实验研究中,血清CORT在各组大鼠中无显著性差异,原因可能与造模肌注氢化可的松的时间有关,有人认为糖皮质激素短期应用造成肾阴虚,长期应用则造成肾阳虚[27-28];也可能与糖皮质激素撤退以后,动物受抑制的下丘脑-垂体-肾上腺轴功能恢复速度与时间有关[29],在激素撤退早期属于肾阳虚,后期可能属于阴阳两虚。具体或更深层次的原因有待进一步研究。

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The Effect of Suspended Moxa Stick Moxibustion on Points Shenshu(BL23) and Guanyuan(CV4) on the Pituitary-adrenal Axis and the Pituitary-thyroid Axis in Rats with Kidney Yang Deficiency

330006,

Objective To investigate the effect of suspended moxa stick moxibustion on points Shenshu(BL23) and Guanyuan(CV4) on the pituitary-adrenal axis and the pituitary-thyroid axis in rats with kidney yang deficiency. Method A rat model of corticosterone kidney yang deficiency was made by intramuscular injection of hydrocortisone. The rats were randomized into model control and moxibustion treatment groups. A blank control group was set up. The moxibustion treatment group received suspended moxa stick moxibustion on points Shenshu and Guanyuan 20 min once daily, for a total of 14 times. After the completion of treatment, serum CORT, ACTH, T3, T4 and TSH contents were measured by ELISA and pituitary expressions of ACTH and TSH mRNA were determined by RT-PCR. Result There was no significant difference in serum CORT (＞0.05), there were significant differences in serum ACTH, T4 and TSH and pituitary ACTH and TSH mRNA (＜0.05) and there was a very significant difference in serum T3 (＜0.01) between the moxibustion treatment and model control groups. There were no significant differences in the above indicators between the moxibustion treatment and blank control groups (＞0.05). Conclusion Suspended moxa stick moxibustion on points Shenshu and Guanyuan produces a therapeutic effect on rat kidney yang deficiency by decreasing serum TSH content, down-regulating pituitary TSH mRNA expression, increasing serum ACTH, T3 and T4 contents and up-regulating pituitary ACTH mRNA expression.

Moxa stick moxibustion; Kidney yang deficiency; Pituitary-adrenal axis; Pituitary-thyroid axis; Rats

1005-0957(2016)12-1469-04

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2016.12.1469

江西省教育厅科技项目(GJJ10559)

闵友江(1975 - ),男,副教授,博士

程立红(1957 - ),女,教授,研究方向为刺灸方法与临床研究

2016-04-20