铅高耐受性细菌的筛选及其吸附去除水中铅的初步研究

邓沙宁，齐利敏

（1.湖南有色冶金劳动保护研究院，湖南长沙 410014；2.湖南有色金属研究院，湖南长沙 410100）

铅高耐受性细菌的筛选及其吸附去除水中铅的初步研究

邓沙宁1，齐利敏2

（1.湖南有色冶金劳动保护研究院，湖南长沙 410014；2.湖南有色金属研究院，湖南长沙 410100）

铅污染会对人体和环境带来巨大危害，我国将其列为优先控制的第一类污染物。研究人员从铅锌冶炼厂冶炼废渣堆放场地周边土壤中分离筛选得到一株细菌Pb－S1，经鉴定为鞘氨醇杆菌，该菌具有良好的铅耐受性，并具有高效稳定的Pb2＋去除和吸附性能，在含铅废水的处理中具有良好的应用前景。

铅耐受性；生物吸附；细菌

铅是一种对人体健康和农作物生长危害极大的重金属元素，会损害人体的神经、消化、免疫和生殖系统，引起痉挛、反应迟钝、贫血、腹痛、消化不良等症状，特别会影响儿童的智力发育［1，2］。铅污染主要来源于铅矿开采和冶炼、电镀、涂料、铅蓄电池制造等行业，它给人体和环境带来的巨大危害已经引起了人们的高度重视。《污水综合排放标准》（GB8978－1996）中将铅列为第一类污染物，是我国优先控制的污染物。

目前含铅废水的处理方法主要有化学沉淀、氧化还原、离子交换和电化学法等，一般仅适于浓度较高重金属离子废水的处理，对浓度较低的废水处理效果较差或成本较高［2］。然而，随着近年来一批新的行业污染排放标准的颁布和实施，尤其是涉重行业，如《铅、锌工业污染物排放标准》（GB 25466－2010）、《铜、镍、钴工业污染物排放标准》（GB 25467－2010）等，将铅的排放限值大幅度地降低至0.5 mg／L，使得传统的含铅废水处理方法无法满足新标准的要求。因此，开发能够对低浓度含铅废水进行深度处理的新型技术成为研究人员的目标。

近年来，迅速兴起的生物处理技术，具有操作简单、投资少、对环境破坏小、二次污染少且专一性较高等优点，尤其对低浓度含铅废水进行深度处理时具有一定的经济优势，成为绿色环保领域研究的热点之一［3～6］。随着环境微生物学的发展，研究人员发现一些微生物如细菌、真菌和酵母能够去除吸附废水溶液中的铅离子［7～10］。在长期受重金属污染的土壤上，存在能耐受重金属污染，并可富集、氧化或还原重金属的微生物种群。由于微生物种类繁多，因此用重金属选择培养基，从中筛选出对土壤重金属具有专性高效富集作用的菌株，并进行分类鉴定，是生物处理技术应用的前提。本研究从分离和筛选高耐受铅微生物的研究角度出发，拟从被铅严重污染的土壤中分离得到对铅具有高耐受性的微生物，对其去除水中铅的能力进行研究和探讨。

1 材料与方法

1.1 试剂、培养基和土壤样品

采用优级纯硝酸铅配制Pb2＋浓度为5 000mg／L的铅标准溶液待用。

LB培养基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，无菌蒸馏水1 L。

液体驯化培养基：LB培养基中加入Pb2＋1 g。

固体筛选培养基：液体驯化培养基培养几种加入15～20 g琼脂粉。

含铅的土壤样品取自湖南某铅锌冶炼厂冶炼废渣堆放场地。

1.2 菌株的驯化、分离

取含铅土壤样品100 g，接种至1 000 mL的驯化培养基中，在30℃、120 r／min转速下培养24 h后，取100 mL培养液接种至1 000 mL新的驯化培养基中。重复以上驯化过程3次以后，取适量菌液稀释一定的倍数，再分别吸取0.1 m L稀释液涂布于固体筛选培养基平板上。接种后移入恒温培养箱中，30℃恒温培养，直到培养基表面观察到菌落。根据菌落形态不同，挑取单菌落，移种转接到新的固体筛选培养基中进行培养。反复进行上述操作，同时用显微镜检查，直至获得纯菌株。以上操作均在严格无菌条件下进行。

1.3 耐铅菌的筛选和鉴定

使用721型紫外可见分光光度计于600 nm波长处测定培养液吸光度，以OD600表示细菌的生物量，绘制菌种的生长曲线。

将分离筛选得到的菌株接种至含不同浓度Pb2＋（0～3 000 mg／L）的LB培养基中，测定其生长情况，并根据生长情况判断菌种对铅的耐受性能，筛选出对铅具有高耐受性的菌株。将筛选得到的具有铅高耐受性的菌株送至上海生工生物工程有限公司进行菌种的鉴定。

1.4 耐铅菌对铅的去除性能

将筛选获得的对铅耐受性的菌株接种至含不同浓度Pb2＋（0～1 000 mg／L）的LB培养基中，培养一定时间后取适量培养液，5 000 r／min离心5 min，取适量上清液，采用原子分光光度法测定其中Pb2＋浓度。以不接种菌体组作为对照组，每组样品重复3次。去除率按照下列公式计算：

式中：P为铅的去除率／%；C0（Pb2＋）为原培养液中Pb2＋的浓度／mg·L－1；C（Pb2＋）为铅耐受菌生长一段时间后培养液中Pb2＋的浓度／mg·L－1。

1.5 耐铅菌对铅的生物吸附性能

将耐铅菌株接种于pH为中性的LB培养基中，30℃、120 r／min培养24 h之后，在5 000 r／min离心5min，将培养基与菌体分离，菌体用无菌蒸馏水洗涤后转移到培养皿中，80℃恒温干燥24 h。将干燥后的菌体细胞研磨、粉碎，作为生物吸附剂备用。

取0.1 g生物吸附剂加入250 mL厄氏烧瓶中，于30℃、pH为中性的条件下测定生物吸附剂对铅的吸附性能。生物吸附剂与铅离子溶液混合后，立即放置在水浴恒温振荡器中，120 r／min振荡60 min。为避免操作过程中可能发生的化学沉降、被容器壁吸附等造成的误差，试验条件下同时做空白试验（即不加吸附剂）。吸附试验铅离子浓度为100 mg／L，每隔10 min取样进行分析。样品先经10 000 r／min离心5 min后，采用原子吸收分光光度法测定上清液中的Pb2＋浓度。

所有试验重复3遍，通过标准方差检验试验误差，最后取平均值。

2 结果与讨论

2.1 耐铅菌的分离

经过富集和分离，从所采土样中分离出3株耐铅细菌，分别编号为Pb－S1、Pb－S2和Pb－S3。菌株Pb－S1菌落颜色为白色圆形，菌落表面光滑不透明，易于挑起，黏稠，菌落直径为2～4 mm；菌株Pb－S2菌落颜色为浅绿色，菌落直径小于3～5 mm，中央突起，菌落为圆形，表面光滑，边缘整齐，易于挑起，黏稠；菌株Pb－S3菌落颜色为浅绿色，菌落直径小于2～4 mm，中央突起，菌落为圆形，表面粗糙，边缘整齐，易于挑起，黏稠。革兰氏染色试验表明Pb－S1、Pb－S2为革兰氏阴性菌，Pb－S3为革兰氏阳性菌。对分离得到的这三株铅耐受菌进行下一步的耐铅性能测试，以获得对铅具有高耐受性的菌株。

2.2 高耐铅菌的筛选和鉴定

在不同初始铅浓度的LB培养液中分别接入Pb－S1、Pb－S2和Pb－S3菌，每隔12 h测定菌株的生长情况，判断菌株的耐铅性能。图1、图2、图3分别为Pb－S1、Pb－S2和Pb－S3菌在Pb2＋浓度为0～3 000 mg／L范围内培养基中生长情况，试验结果表明Pb2＋浓度在2 000 mg／L以下时，3株耐菌均能够生长，当Pb2＋浓度达到3 000 mg／L则无法再生长。随着Pb2＋浓度的升高，3株菌的生长都逐渐受到抑制；在Pb2＋浓度为500 mg／L时，Pb－S1的生长基本没有受到影响，Pb－S2和Pb－S3则有些轻微的下降；Pb2＋浓度达到1 000 mg／L时，Pb－S1的生长也开始受到轻微的影响，Pb－S2和Pb－S3则明显开始被抑制；Pb2＋浓度继续上升到达到2 000mg／L后，Pb－S1的生长也受到了限制的抑制，Pb－S2和Pb－S3虽然还能生长，但生长非常缓慢，活性限制降低。总体上来说，研究筛选得到的3株细菌，都具有较高的耐受铅的能力，均明显高于一些文献报道的芽孢杆菌［8］、拉微球菌［9］和卡氏菌［10］。此外，在这3株菌种，又以Pb－S1显示出更高的铅耐受性，在Pb2＋浓度高达2 000 mg／L仍能较好地生长，因此对其进行了进一步的菌株鉴定研究，结果表明Pb－S1为鞘氨醇杆菌属的一个菌种。

图1 菌株Pb－S1在不同Pb2＋浓度下的生长情况

图2 菌株Pb－S2在不同Pb2＋浓度下的生长情况

图3 菌株Pb－S3在不同Pb2＋浓度下的生长情况

2.3 高耐铅菌对铅的去除能力

为测定筛选获得的高耐铅菌Pb－S1对铅的去除能力，将其接种至Pb2＋浓度为0～2 000 mg／L的LB培养基中培养72 h后，测定培养液中残留的Pb2＋含量，结果如图4所示。结果表明，Pb2＋浓度在400～2 000 mg／L范围内，菌株Pb－S1对Pb2＋均具有良好的去除能力。Pb2＋浓度在400 mg／L时，基本上可以全部去除培养液中的Pb2＋，去除率达到了99%以上。随着Pb2＋浓度的升高，Pb2＋去除率逐渐下降，当Pb2＋浓度升高到2 000mg／L，去除率下降到只有51.6%。虽然在较高的Pb2＋浓度时，由于铅对菌株Pb－S1的毒害作用，会使其生长收到明显的抑制，但并不妨碍正常的新陈代谢活动。本试验所分离出的Pb－S1不仅具有很好的耐铅性，而且有很强的去除铅的能力，在铅污染水体的生物修复中具有很好的应用前景。

图4 菌株Pb－S1在不同Pb2＋浓度下对Pb2＋的去除率

2.4 高耐铅菌对铅的生物吸附性能

为进一步考察菌株Pb－S1对Pb2＋的生物吸附性能，本试验进一步利用Pb－S1的菌体制备了生物吸附剂，并测定了其吸附去除水中Pb2＋的能力。考虑到生物吸附剂大多数应用于重金属废水处理的深度净化过程，因此研究的生物吸附试验所用的溶液Pb2＋浓度为100 mg／L，主要考察的是Pb－S1生物吸附剂深度处理含铅废水的性能，结果如图5所示。结果表明，在Pb2＋浓度为100 mg／L，加入0.1 g Pb－S1制备的生物吸附剂后，吸附10 min后，吸附过程基本完成。在随后的50 min内，对Pb2＋的吸附基本没有发生变化，整个过程水中残留的Pb2＋均稳定在0.4 mg／L以下，显著低于《铅、锌工业污染物排放标准》（GB 25466－2010）、《铜、镍、钴工业污染物排放标准》（GB 25467－2010）等国标要求的0.5mg／L的排放标准。试验结果说明Pb－S1生物吸附剂对Pb2＋的吸附迅速而稳定，对于生物吸附剂应用于重金属废水的生物吸附处理非常有利。

图5 菌株Pb－S1制备的生物吸附剂对Pb2＋的吸附性能

3 结 论

研究结果表明，从被Pb严重污染的土壤中可筛选得到对铅具有高耐受性的菌株；本试验分离得到了一株细菌Pb－S1可以耐受浓度高达2 000 mg／L的Pb2＋，并在Pb2＋浓度为400～2 000 mg／L的范围内具有很好的去除Pb2＋的能力，去除率达到99%以上；利用Pb－S1制备的生物吸附剂，在处理浓度低于100 mg／L的Pb2＋溶液时具有高效快速的生物吸附性能，处理后溶液中的Pb2＋浓度稳定在0.4 mg／L以下，低于《铅、锌工业污染物排放标准》（GB 25466－2010）、《铜、镍、钴工业污染物排放标准》（GB 25467－2010）等要求的排放标准；细菌Pb－S1在去除水中Pb2＋的应用中显示出很好的前景。

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Screening of Lead-tolerant Microbes and Prelim inary Study on Their Rem oval Capability of Lead in Liquidoid

DENG Sha-ning1，QILi-min2
（1.Hunan Labor Protection Institute of NonferrousMetals，Changsha 410014，China；2.Hunan Research Institute of NonferrousMetals，Changsha 410100，China）

Lead is the first category pollutant in China because of the great harm to human body and environment.In the study，a bacterial strain Pb-S1 was isolated from the soil that was seriously polluted by the slag from lead smeltery.Pb-S1 was capable of removing and adsorbing Pb2＋in liquidoid.

lead tolerance；biosorption；bacteria

X758

A

1003－5540（2016）05－0052－04

2016－06－28

邓沙宁（1983－），男，工程师，主要从事安全工程方向的研究工作。