越南人参皂苷R7抑制LPS及TNF勃α联合诱导大鼠星形胶质细胞C6的激活作用研究

王晓双 黄韬 秦力悦 李鸿丽 兰云意 吴辉 张蓓蓓 石海莲 吴晓俊 王峥涛

[摘要]该研究旨在探讨越南人参皂苷R7（R7）对LPS及TNFα联合诱导下大鼠星形胶质细胞C6的激活抑制作用及机制。取对数生长的C6细胞，在无血清的DMEM培养基中饥饿培养24 h后，使用025%胰酶将其消化收集，按15×106个/mL密度接入培养板中培养过夜。实验分组如下：对照组（无药物处理），模型组（LPS 1 mg·L-1，TNFα 10 μg·L-1处理24 h），给药组（分别用625，125，25，50，75 μmol·L-1 R7， 4 μmol·L-1 LNMMA预处理2 h后，再经过LPS 1 mg·L-1，TNFα 10 μg·L-1刺激24 h）。处理之后，CCK8法检测细胞活力，Griess法检测培养基中NO含量，ELISA法检测培养基中IL6，TNFα浓度，实时定量PCR法检测细胞中相关炎症基因的表达，双荧光素酶报告基因法检测细胞中NFκB信号分子的激活。研究发现，与模型组相对比，R7量效相关性降低C6细胞的NO释放水平，其IC50约为34 μmol·L-1；同时，R7减少LPS及TNFα刺激造成的细胞增殖。50 μmol·L-1 R7可以显著降低iNOS （P<0001），TNFα （P<0001），IL1β（P<005）以及COX2 （P<0001）的基因表达，不能下调IL6的基因表达，但可以减少TNFα （P<0001）及IL6 （P<0001）的释放。进一步的研究表明，不同剂量R7（25，50，100 μmol·L-1）均可显著抑制NFκB转录活性（P<005， P<001及P<0001）。研究表明，R7可以抑制LPS及TNFα联合诱导炎症因子基因表达及分泌，其作用可能与其抑制NFκB转录活性相关，提示其在神经炎症相关中枢神经系统疾病中可能的治疗作用。

[关键词]神经炎症；越南人参皂苷R7；脂多糖；炎症因子；NFκB；星形胶质细胞

[Abstract]To investigate the inhibitory effect and mechanism of vinaginsenoside R7 （R7） on the activation of rat C6 astrocytes cells induced by LPS/TNFα， cells in logarithmic growth phase were cultured in DMEM medium without FBS for 24 h After dissociated using 025% EDTAtrypsin， the cells were seeded into respective plates at the density of 15×106 cells per mL and cultured overnight The cells were divided into the following groups： control group （no treatment）， model group （treated with LPS 1 μg·mL-1 and TNFα 10 μg·L-1 treated for 24 h）， R7 groups （pretreated with 625， 125， 25， 50， and 75 μmol·L-1 R7， 4 μmol·L-1 LNMMA for 2 h and then stimulated with LPS 1 mg·L-1 and TNFα 10 μg·L-1 for 24 h） Cell viability was analyzed by CCK8 kit Secretion of nitric oxide （NO） in the medium was measured by Greiss method Concentrations of interleukin6 （IL6） and tumor necrosis factor （TNFα） were assayed by ELISA kits Gene expressions of inflammatory factors were examined by quantitativePCR analysis Activation of NFκB was detected by dual luciferase reporter gene assay kit The results showed that R7 could significantly inhibit the secretion of NO from C6 cells in a doseeffect manner， with an IC50 of 34 μmol·L-1 And it could reduce cell proliferation induced by LPS/TNFα stimulation Furthermore， R7 at 50 μmol·L-1 significantly downregulated gene expressions of iNOS （P<0001）， TNFα （P<0001）， IL1β（P<005）， and COX2 （P<0001）， but could not change gene expression of IL6 However， R7 reduced the secretion of TNFα （P<0001） and IL6 （P<0001） Further studies disclosed that， different concentrations of R7 （25， 50， 100 μmol·L-1） could significantly inhibit the transcription activity of NFκB（P<005， P<001， and P<0001） In conclusion， R7 could inhibit inflammatory responses in C6 cells induced by LPS/TNFα probably by inhibiting the transcription activity of NFκB， which indicates its possible therapeutic effect in neurological diseases related to neuroinflammation

[Key words]neuroinflammtion；vinaginsenoside R7；LPS； inflammatory factor； NFκB； astrocyte

doi：10.4268/cjcmm20160822

星形胶质细胞（astrocyte）是哺乳动物脑中数量最多的一类细胞，而胶质酸性纤维蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）为其主要特征成分之一。中枢神经系统疾病的发病过程中，常常伴随着神经炎症，对病程的发展往往起促进作用。神经炎症的发生主要由脑内胶质细胞，包括星形胶质细胞和小胶质细胞参与。在炎症条件的刺激下，胶质细胞释放大量炎症因子，破坏血脑屏障通透性。而在神经炎症进程中，星形胶质细胞的激活具有2个方面的作用：一方面，通过释放神经促炎因子，趋化因子和补体系统成分调节免疫响应；另一方面，产生神经保护因子例如神经生长因子、神经营养因子等，对神经系统具有修复及保护作用。越南人参皂苷R7（vinaginsenoside R7，R7）为越南人参Panax vietnamensis的主要成分之一[1]，属达玛烷型皂苷，在中药三七P notoginseng （Burk） FHChen中也大量存在，为稀有三七皂苷ST4酶转化原料[2]。尽管早在1994年已从越南人参中分离得到[1]，目前对R7药理作用的研究尚属空白。本实验使用脂多糖（LPS）及炎症因子TNFα联合诱导大鼠星形胶质C6细胞，建立神经炎症模型，通过检测NO的释放，细胞存活率，相关炎症基因表达，以及炎症因子的释放，探讨R7对神经炎症的影响。并且，通过检测NFκB报告基因表达，研究R7对神经炎症的可能的调控机制。研究结果可能为R7临床用于神经炎症治疗提供理论依据。

1材料

大鼠星形胶质细胞株C6购于中国科学院细胞库。

二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO，货号RNBD2520）购自美国Sigma公司；R7购自上海中药标准化研究中心，用DMSO溶解配制成50 mmol·L-1的贮存母液；DMEM培养基（货号1661023），胎牛血清（FBS，货号8172881），025%胰酶（trypsin，货号25200072），鼠尾胶原（货号1636475）均购自美国GIBCO公司；细胞培养瓶，培养皿，培养板等购自Eppendorf公司；CoolCell细胞程序降温盒（Biocision，批号BCS1360）； TNFα ELISA试剂盒（Lot：E094951644）购自eBioscience公司；NFκB质粒由上海中医药大学中药研究所窦薇副研究员馈赠；APS （Lot：ZQ0922B4013），Tris （Lot：AT08BA0008），Glycine （Lot：A811BA0011），SDS （Lot：ZQ0508B10014J），IL6 ELISA试剂盒（Lot：120401/D），反转录cDNA试剂盒（Lot：00155096），Taqman SYBR kit购自Life Technologies公司；β巯基乙醇，甘氨酸，TEMED均购自Geneview公司；BCA蛋白定量试剂盒，PBS粉末，5×SDS 蛋白电泳缓冲液（Lot：3609001100），DNA marker等均购自鼎国生物有限公司；30%丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺 （Lot NO：A01191），4×TrisHClSDS分离胶缓冲液pH 88 （Lot NO：T15356），4×TrisHClSDS浓缩胶缓冲液pH 68 （Lot NO：T16881）均购自翎圣生物；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自Promega公司。

电子天平购自Sartorius（型号BP211D）；振荡仪购自Qilinbeier（型号VORTEX5）；台式高速离心机（型号Centrifuge 5810R），高速离心机（型号5415R）均购自Eppendorf公司；荧光显微镜（（型号CKX41）购自Olympus公司；酶标仪（型号Varioskan Flash），CO2培养箱（HERAcell 150i），超净工作台（型号1300 SERIES A2）均购自Thermo公司；细胞计数仪（型号Moxiz）购自Orflo公司；电热恒温水浴锅购自北京市长风仪器仪表公司；GloMax 20/20 Luminometer（货号E5311）购自Promega公司。

2方法

21C6细胞培养及药物处理C6细胞于DMEM培养基（含10%胎牛血清，100 U·mL-1青霉素，100 mg·L-1链霉素），37 ℃，5% CO2饱和湿度培养箱中培养并传代。药物处理如下：取对数生长的C6细胞，更换为无血清的DMEM培养基进行饥饿处理，24 h后使用025%胰酶将其消化收集，按15×106个/mL密度接入96孔板饥饿培养过夜。实验分组如下：对照组（无药物处理），模型组（LPS 1 mg·L-1，TNFα 10 μg·L-1），给药组（分别用625，125，50，75 μmol·L-1 R7， 4 μmol·L-1 LNMMA预处理2 h后，再经过LPS 1 mg·L-1，TNFα 10 μg·L-1刺激24 h）。

22NO，细胞存活率及毒性检测NO含量测定采用Griess法，操作如下：收集培养基上清80 μL，与等体积Griess试剂混合，室温静置15 min后，酶标

仪于540 nm波长处测定吸光度；以NaNO2作为标准品，同样方法反应后，绘制标准曲线，进行培养基中NO含量标定。NO的抑制率计算方法如下：抑制率=（[NO2-]LPS/TNFα-[NO2-]LPS/TNFα+样品）/（[NO2-]LPS/TNFα-[NO2-]对照）×100%[3]。细胞存活率及毒性测定采用CCK8法，步骤如下：96孔板中每孔加入10 μL的CCK8溶液，放入培养箱内孵育15 min，酶标仪于450 nm波长处检测吸光度，细胞存活率计算方法参照试剂盒说明，存活率=（给药组吸光度-对照组吸光度）/对照组吸光度×100%。

23炎症基因表达分析于60 mm2培养皿中接种细胞，按21项下处理方法，进行药物处理，收取细胞样品，TRIzol法提取总RNA，去除DNA污染后，使用反转录cDNA试剂盒处理，反转录为cDNA，按照Taqman SYBR kit试剂盒说明方法进行实时定量PCR。PCR使用引物序列见表1。

24IL6和TNFα检测于60 mm2培养皿中接种细胞，按21项下方法，对其进行药物处理后，取100 μL细胞培养基，分别按照ELISA试剂盒使用说明，测定其中IL6及TNFα的含量。

25NFκB转录活性检测采用双荧光素酶报告基因检测法，取对数生长C6细胞，按15×106个/mL浓度接入24孔板过夜培养，至细胞生长90%，吸出24孔板中上清液，使用PBS清洗，每孔加入500 μL OptiMEM；按要求配制混合NFκB质粒（05 μg/孔），每管加75 μL OptiMEM，同时配制lipofectamine 2000，二者混合，静置5 min后按比例加入板中。实验分组如下：对照组（未进行药物处理），模型组（LPS 1 mg·L-1，TNFα 10 μg·L-1），给药组（分别用25，50，100 μmol·L-1 R7预处理2 h后，再经过LPS 1 mg·L-1，TNFα 10 μg·L-1刺激24 h）。按照双荧光报告基因检测试剂盒说明，检测NFκB的激活。

26统计学处理所有数据均采用±s表示，运用PrismDemo 50统计软件，进行多组间统计分析，经OneWay ANOVA Dunnett检验，P<005表示有统计学意义。

3结果

31R7对NO释放影响LPS和TNFα联合处理，可以显著刺激C6星形胶质细胞释放NO （P<0001）；而R7可以浓度依赖性抑制C6细胞在炎症因子刺激之下释放NO，随着R7浓度的增加，培养基中NO的含量逐渐降低，其半数抑制率IC50约为34 μmol·L-1，见图1。

与模型组相比1）P<005， 2） P<001， 3） P<0001（图2～5同）。

图1R7对LPS/TNFα诱导的C6细胞NO释放的作用

Fig1Effect of R7 on LPS/TNFα induced NO release in C6 cells

32R7对细胞活力及毒性的影响因NO的释放与细胞数目密切相关，为了考察R7对C6细胞在LPS及TNFα刺激之下NO释放的抑制是否与其抑制C6细胞活力密切相关，本实验采用了CCK8法检测C6细胞的活力，结果见图2。LPS和TNFα显著增加细胞的活力（P<0001）；R7对炎症因子刺激导致细胞活力的上升具有显著性抑制作用，尤其在R7剂量高于50 μmol·L-1时，作用最为显著；LPS/TNFα联合刺激C6细胞可以使细胞增殖。同时使用CCK8法检测R7高浓度对细胞的毒性作用；R7高浓度对C6细胞并无毒性作用。结果表明，R7对NO释放的抑制作用与其抑制LPS/TNFα对细胞的增殖作用有关。

图2R7对C6细胞存活率及毒性的影响

Fig2Effect of R7 on C6 cell viability and toxicity

33R7对炎症基因表达的影响基于NO释放的检测结果，本实验进一步考察了R7对C6细胞在受到炎症因子刺激时，所诱导的炎症因子的基因表达，结果见图3。LPS和TNFα联合刺激显著增加细胞中iNOS （P<0001），TNFα（P< 0001），IL6（P<0001），IL1β（P<001）及COX2（P<0001）的基因表达；而R7（50 μmol·L-1）处理，显著降低C6细胞中iNOS （P<0001），TNFα（P<0001），IL1β（P<005）和COX2 （P<0001）的基因表达，对TLR4有下调趋势，但不能抑制IL6基因表达。阳性药LNMMA可以抑制iNOS（P<005），TNFα（P<0001）及COX2（P<005）基因表达，但不影响IL6，IL1β和TLR4的基因表达。

34R7对炎症细胞释放IL6和TNFα的影响为了验证基因表达检测的结果，同时确认R7对IL6是否有调节作用，本研究采用ELISA法，分别检测了细胞培养基中的IL6和TNFα的含量，结果见图4。与对照组相比，模型组的IL6，TNFα释放量显著增加（P<0001），而R7（50 μmol·L-1）可以显著抑制C6细胞中IL6，TNFα的释放（P<0001）。阳性药LNMMA仅能显著抑制TNFα的释放（P<005），而对IL6的分泌无影响。

35R7对NFκB转录活性的影响LPS和TNFα联合刺激，显著增强细胞中NFκB蛋白的转录活性（P<0001）；而不同剂量的R7处理，均可以显著抑制其转录活性，当其浓度达到100 μmol·L-1时抑制效果最为显著（P<0001），见图5。

4讨论

R7尽管发现于20多年以前，但本实验首次发现其具有抑制星形胶质细胞激活的作用，它可以显著抑制LPS及TNFα刺激下的星形胶质细胞C6的激活，减少细胞中NO释放，IL6及TNFα的分泌，调控炎症基因iNOS，TNFα及COX2的表达，而其作用可能是通过降低NFκB转录因子的激活实现。

星形胶质细胞作为神经系统主要的神经细胞，在中枢神经系统（CNS）中负责提供营养，维持神经递质传递，同时具有广泛维持脑内环境平衡的功能。神经炎症是由胶质细胞激活参与的病理反应[4]。过去认为在神经系统中，小胶质细胞为神经炎症主要的参与对象[5]。后来的研究发现，在脂多糖及炎症因子等外来刺激、损伤或疾病时，星形胶质细胞也进入激活状态，表现为GFAP显著升高，释放NO，IL6，TNFα[6]等致炎因子，并向小胶质细胞传递炎症信号，促进小胶质细胞激活，进一步扩大炎症反应[78]。本实验中R7对于下游NO释放的显著抑制作用，并减少IL6和TNFα等致炎因子的分泌，表明其可有效减轻星形胶质细胞激活导致的炎症进程。

脂多糖为革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分，常用于诱导炎症模型的发生。LBP和CD14帮助TLR4受体识别LPS，形成TLR4/MD2受体复合物，通过MyD88依赖性通路及TRIF通路，分别释放促炎因子和Ι型干扰素基因[9]。炎症因子TNFα全名肿瘤坏死因子α，为一种系统性炎症的细胞因子，可引起急性炎症反应。当其结合TNFR1或TNFR2受体时形成三聚体，发生构象改变使抑制蛋白SODD从细胞内致死区域分离，从而使接头蛋白TRADD连接至细胞致死区域，激活下方3种通路途径[1011]。无论由脂多糖结合TLR4受体，还是由炎症因子TNFα诱导的TNFα信号通路，最终都引起NFκB转位入核，结合靶基因启动位点后诱导不同致炎因子的表达[12]。NFκB入核后激活细胞核内相关炎症基因，上调IL1β，IL6基因的表达，刺激细胞分泌IL1β，IL6等下游产物。本实验中，R7显著性抑制NFκB启动入核结合的表达，IL1β，IL6基因表达，减少细胞分泌IL1β，IL6，表明R7确实具有抑制炎症作用。

本实验CCK细胞活力检测结果显示R7可以通过抑制由LPS/TNFα联合刺激C6细胞引起的活力的增加，提示其可能抑制星形细胞的增殖，与此同时R7并未下调细胞中IL6基因的表达，但减少了IL6的分泌，表明R7可能通过影响细胞数量降低IL6蛋白的分泌。

本实验采用LNMMA作为阳性对照药物，研究表明，该化合物主要为总NOS抑制剂，可以有效降低NO的生成。在本实验中，LNMMA的确如文献报道[13]所述，可以有效抑制C6细胞NO的产生，与此同时，它也可以有效抑制iNOS，TNFα及COX2（P<005）的基因表达；NFκB转录活性测定亦表明它可以有效抑制NFκB。这些结果提示，LNMMA的作用靶点可能并不唯一。

综上所述，本实验发现R7不仅可以抑制神经炎症中下游代谢产物的生成，还影响多种炎症基因的表达，降低炎症过程中炎症因子的分泌，其机制与抑制NFκB转录因子的转录活性相关，提示其在神经炎症相关中枢神经系统疾病治疗中的作用。

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[责任编辑马超一]