感冒灵提取过程近红外光谱在线检测技术研究

陈国权 潘红烨 刘雪松 张跃飞 邵平 王龙虎

[摘要]中药材提取过程是感冒灵颗粒剂生产过程的首个环节，对药品质量影响显著。该文在线采集感冒灵中药材提取过程近红外光谱图，以高效液相色谱和差重法为参照方法，采用一阶导数法处理近红外光谱，运用偏最小二乘回归法（PLSR）分别建立提取液中蒙花苷、绿原酸和固含量的定量校正模型。采用相关系数（r）、交叉验证均方差（RMSECV）、校正集均方差（RMSEC）和验证集均方差（RMSEP）等指标优化建模参数，考察模型性能。3种质量控制指标的模型相关系数均达到095以上，蒙花苷和绿原酸、固含量的RMSEC和RMSEP分别为0010 4和0009 47，0009 34和0142，0055 5和0008 42，在线分析所建模型，预测值与实际测定值相关系数均大于097，其预测相对偏差（RSEP）分别为814%，817%，986%。研究结果表明，利用近红外光谱技术可以实现感冒灵中药提取过程多指标的在线检测和实时监控，该技术可用于生产过程中质量控制，缩小中间体批次差异性，保证药品质量稳定性，也为后续的产品质量回溯提供了实时生产数据。

[关键词]近红外光谱；提取过程；在线监测；感冒灵

[Abstract] Extraction of the four Chinese herbals is the beginning step of the production process of coldrine granules and influences on drug quality significantly In this paper， the online near infrared spectrum was collected during the extraction process of coldrine and then preprocessed by the first derivative Partial least square regression （PLSR） model was developed for the quantity indicators of linarin， chlorogenic acid and solid content， according to results of both HPLC and weightloss as reference methods The correlation coefficient， root mean square error of crossvalidation （RMSECV）， root mean square error of calibration （RMSEC） and root mean square error of prediction （RMSEP） were used to optimize model parameters and confirm their performance Correlation coefficients of three quality control indicator models reached more than 095Values of RMSEC of linarin， chloroenic acid and solid content were 0010 4， 0009 34 and 0055 5， respectively And the values of RMSEP were 0009 47， 0142 and 0008 42， respectively The models， built online analyze data， revealed that the correlation coefficients of predicted values and measured values were greater than 097 and values of RSEP of linarin， chloroenic acid and solid content were 814%， 817% and 986%， respectively The results showed that the NIR method could achieve the online detection and realtime monitoring of multiindexes during the extraction process of coldrine The technology could be used for drug quality control in the process of practical production， reducing the batch differences and ensuring pharmaceutical quality stability In addition， it could provide realtime production data for subsequent product quality backtracking

[Key words]nearinfrared spectroscopy； extraction process； online monitoring； coldrine granules

doi：10.4268/cjcmm20160804

近红外光谱技术（nearinfrared spectroscopy）因其无污染、样品无需前处理和快速检测等优点[13]，已经广泛应用于中药原药材质量快速评价[45]、生产过程在线质量控制及成品的有效成分含量快速测定等方面[6]。感冒灵颗粒[7]是由三叉苦、野菊花、岗梅、金盏银盘等4味中药与对乙酰氨基酚、马来酸氯苯那敏、咖啡因等化药组成的，中西结合治疗感冒的药品。在感冒灵颗粒生产过程，中药材的提取[8]是其首个环节，而且提取工艺会直接影响药品的质量与疗效。在感冒灵大品种技术升级项目实施过程中，为了提高中药生产工艺并建立有效的过程控制方法，本文研究了感冒灵中药提取过程实时监控技术，即采用近红外光谱技术建立感冒灵提取液中固含量、蒙花苷和绿原酸含量的在线检测模型，实现了中药提取装置内溶液3个指标成分含量变化的实时监控。感冒灵提取过程近红外光谱在线检测技术的应用，不仅有利于对感冒灵提取过程的质量控制，也为药品质量回溯提供了大量的基础数据。

1材料

1 000 L多功能中药提取设备（浙江温兄机械阀门有限公司）；Bruker MATRIXF近红外光谱仪（德国布鲁克），配有透射检测器和采样系统；Waters alliance E2695高效液相色谱仪（Waters，USA）；H1650W高速离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）；SG5200 HPT超声波清洗机（上海冠特超声仪器有限公司）。

野菊花、三叉苦、金盏银盘和岗梅药材均由华润三九医药股份有限公司提供，并由浙江大学药学院徐娟华副教授鉴定，分别为菊科植物野菊的干燥头状花序、芸香科植物三叉苦的干燥茎和枝、菊科植物金盏银盘的干燥全草、冬青科植物梅叶冬青的干燥根及茎。

乙腈（色谱纯，默克公司）；甲酸（分析纯，阿拉丁公司）。蒙花苷对照品（成都曼斯特生物科技有限公司，MUST15101207）、绿原酸对照品（成都曼斯特生物科技有限公司，MUST15041814），纯度995%。

2方法

21提取工艺与近红外光谱采集

生产过程在线监测系统见图1。每次取100 kg中药材（三叉苦273 kg、野菊花137 kg、金盏银盘182 kg、岗梅409 kg）于提取罐中，加水煎煮提取2次，每次2 h。整个提取过程实现升温、保温、煎煮、出药和除渣的全自动控制。

为提高测量精度和准确性，本研究建立了新的近红外在线检测系统，并采用静态光谱采集方法。采集光谱前，关闭阀门1～3；光谱采集完成后，打开阀门3，开始取样；取样结束后，关闭阀门3，同时开启阀门1和2，使新鲜药液持续经过流通池。采集参数如下：光谱采集时间间隔10 min，以空气为参比，扫描次数32次，分辨率8 cm-1，扫描范围4 000～12 000 cm-1。光谱数据的采集、传输和处理通过OPUS软件完成。

22固含量测定

感冒灵提取过程的固含量测定采用差重法，取烘干至恒重（连续2次称重差异小于5 mg）的扁形瓶（X0），取约5 mL提取液，精密称定（X1），置干燥箱中105 ℃烘5 h，取出置干燥器中冷却30 min，称重，再置干燥箱中烘1 h，精密称重（X2），质量差异5 mg以上者继续置干燥箱中烘，直至差异小于5 mg。根据减失质量，计算供试品中固含量（%）。

固含量=（X2-X0）/（X1-X0）×100%

23绿原酸与蒙花苷含量测定

231 色谱条件色谱柱Waters X Bridge Shield RP18（46 mm×250 mm，5 μm），进样量10 μL，柱温30 ℃，流速10 mL·min-1，检测波长334 nm，流动相05%甲酸（A）乙腈（B），洗脱梯度（0～7 min，13%B；7～27 min，13%～30%B；27～35 min，35%～40%B；后运行15 min）。

232 供试品制备取适量提取液样品溶液于15 mL离心管中，在转速13 000 r·min-1条件下离心10 min，取上清液，即得。

233 对照品制备精密称取2 mg蒙花苷对照品置于20 mL量瓶中，以甲醇溶解定容，备用。精确称取2 mg绿原酸对照品于20 mL量瓶中，以甲醇溶解定容，备用。

234线性、精密度和重复性考察取蒙花苷储备液，按梯度进行稀释，配成9个不同浓度的工作液，进样分析。以色谱峰面积（Y）对进样浓度（X）进行线性回归。线性范围为0～1202 g·L-1，r=0999 5。

取绿原酸储备液，按梯度进行稀释，配成9个不同浓度的工作液，进样分析。以色谱峰面积（Y）对进样浓度（X）进行线性回归。线性范围为0～0324 1 g·L-1，r =0999 9。

取批号为15121201的提取终点样品，按232方法处理后，按231液相条件连续进样6次，绿原酸和蒙花苷的峰面积RSD分别为052%，050%，表明仪器精密度良好。

取相同提取液，按照232方法制备6份样品溶液，以231色谱条件，测得6份样品中绿原酸和蒙花苷的峰面积RSD分别为029%，035%，表明该方法重复性良好。

235稳定性考察取批号为15121201的提取终点样品，按照232方法制备样品溶液，以231色谱条件，分别于0，4，8，12，16，20，24，28，32，36 h进样分析。绿原酸和蒙花苷峰面积的RSD分别为067%，041%，结果表明样品溶液在36 h内稳定。

236 加样回收率考察取已知含量的批号为15121201的提取终点样品，分别设置样品含量的80%，100%，120%为低、中、高浓度，每个浓度3个样品，共9个样品，精密量取。分别精密加入相应的低、中、高浓度的对照品，每份均按232项下方法处理后，按231液相条件进样，分别计算绿原酸与蒙花苷的含量。结果显示绿原酸的回收率在99%～100%，RSD 039%，蒙花苷回收率在98%～100%，RSD 073%，表明方法准确可靠，符合定量测定要求。

24数据处理与模型性能评价

运用Bruker公司的OPUS软件的偏最小二乘法（PLSR）建立感冒灵提取过程中提取液的固含量、蒙花苷和绿原酸含量的近红外定量分析模型。模型建立前对校正集光谱进行异常点判别，以提高模型精度，同时原始光谱在平滑、微分等适宜的光谱预处理方法下来消除仪器背景或漂移对信号的影响，选择合适的波段提取有效信息，减少计算量，减小模型复杂程度。本文采用校正集相关系数（rc）、交叉验证均方差（RMSECV）、校正集均方差（RMSEC）和验证集均方差（RMSEP）等指标优化建模参数，考察模型性能。模型对未知样品的预测效果采用预测均方差（RMSEP）、相对偏差（RSEP）和验证集相关系数（rv）来考核。一般来说，模型相关系数越接近于1，RMSEC和RMSEP越小且越接近，分析效果越好，RSEP越小说明模型的预测效果越好。

3结果与讨论

31光谱预处理及波段选择

PLSR可以处理全谱信息，但因包含过多冗余信息，会影响建模效率和增加模型复杂程度，故建模前光谱区间筛选至关重要，以改善模型性能，提高计算速度[9]。感冒灵中药材采取水提法，由于水中的羟基有很强的极性，要特别注意其在近红外谱区的6 944，5 155 cm-1附近以合频与倍频吸收谱带形成的两大“水峰”[1011]，在进行近红外吸收光谱分析时，应尽可能减少其干扰。此外，9 750～12 000 cm-1光谱信息较少，没有显著的特征吸收，为减少计算机运算量，提高建模效率，也不宜建模。在近红外透射光谱的采集过程中，外界环境的变化会引起光谱基线的偏移，随机噪声和样品背景干扰也会影响校正结果[12]。因此，在对近红外光谱进行分析之前，一般要对光谱数据进行预处理，以提高模型的预测准确性。

本研究通过OPUS软件对比研究了各种预处理方法和不同建模波段对提取液的固含量、绿原酸和蒙花苷含量模型的影响，结果见表1。通过比较发现，固含量模型的最佳波段为5 3923～9 4037 cm-1，绿原酸模型的最佳波段为5 4232～54 534 cm-1， 6 2948～6 5031 cm-1，蒙花苷模型的最佳波段为5 39227～5 45398， 6 0943～6 5031 cm-1，采用一阶导数法对光谱进行预处理后能有效消除基线偏移，减少峰与峰之间的重叠并使有效信息显现出来，r较大，且RMSECV较小。

32定量模型的建立

应用OPUS软件自动优化功能，经过异常点判断、光谱预处理和建模波段的选择后，最终得到213个样品用于建模，随机选取183个样品作为校正集。用偏最小二乘法建立感冒灵提取过程固含量、绿原酸和蒙花苷含量的近红外定量校正模型，分别获得提取过程固含量模型、绿原酸模型和蒙花苷模型的校正集实测值和NIR预测值的相关性图，见图2。蒙花苷、绿原酸和固含量定量模型校正集相关系数分别为0956 5，0965 3，0995 2，RMSEC分别为0010 4，0009 34，0055 5，说明模型性能良好。

33各质量控制指标在线分析

将预先建立的模型导入系统工作站，在线采集近红外光谱，所得近红外光谱自动导入所建模型中，同步预测感冒灵提取过程中固含量、蒙花苷和绿原酸含量信息，并在工作站中实时显示各质量控制指标含量的变化趋势。为进一步验证在线检测结果的准确性，本文将近红外检测数据（预测值）与传统方法检测结果（实测值）进行比较，见图3。

数据统计分析表明，提取液的固含量、绿原酸和蒙花苷的RMSEC和RMSEP分别为0055 5和0008 42，0009 34和0142，0010 4和0009 47，其预测相对偏差（RSEP）分别为986%，817%，814%，可满足生产过程实时分析的精度要求。在提取过程中浓度变化趋势上，在线检测结果和传统方法是一致。所以，近红外在线方法基本与提取工艺的结果是吻合的。

不同的指标，预测精度有所差异。相对地，固含量定量模型要优于绿原酸和蒙花苷定量模型，其原因在于其含量较大且该指标测定的是提取液中所含固体物质，受水峰影响较小。一煎过程中25～80 min绿原酸含量的预测值要低于实测值，二煎初期各指标预测值较实测值略高。其原因是由于该批次的提取过程初期工况尚不稳定。此外，提取液静置时液体中颗粒物沉降不完全、提取温度变化等因素也会影响近红外光谱的采集。

4结论

近年来，关于近红外在线分析方法的研究和应用日益受到重视，但是真正意义上在生产设备上实施该技术的并不多见。在感冒灵工业生产的提取装置上，本文建立了近红外在线检测系统，研究了蒙花苷、绿原酸和固含量等指标成分的分析方法，并用传统分析方法对这些检测结果进行检验，客观地评价近红外在线分析方法的误差范围。生产过程的应用实践表明，本文所建立的模型预测精度高，准确度高，满足中药制剂实际生产中定量分析的要求。该法与传统药典方法相比，在保证准确度的基础上，大大提高了分析效率，为实时监控中药生产过程关键质量指标变化提供了可行方法，同时为后续的产品质量回溯提供了大量的实时生产数据。

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[责任编辑孔晶晶]