呼吸道上皮细胞培养模式与纤毛摆动频率的研究进展

李童斐 秦生辉

[摘要] 呼吸道上皮细胞在呼吸疾病的发生发展中占有重要的地位，哺乳动物呼吸道上皮表面覆盖有纤毛，纤毛的摆动可以保护呼吸系统免于细菌、病毒以及其他致病因素的损害。因此纤毛摆动频率（CBF）的调控成为许多呼吸疾病发生发展的关键因素，可以用来研究呼吸道炎症、吸烟、感染、呼吸系统肿瘤等多种疾病。体外研究CBF的方法多是采用借助呼吸道上皮细胞培养以及活体呼吸道上皮分离等手段，但呼吸道上皮细胞的原代培养具有杂细胞多、不易分化纤毛等诸多问题。呼吸道上皮细胞的培养模式不断发展，本文简述了呼吸道上皮细胞主要的两种原代培养模式及各自的主要培养方法及改进发展情况，同时介绍并总结了呼吸道上皮细胞纤毛分化的鉴定及其摆动频率的检测，明确了各类培养模式对操作流程、培养周期、尤其是纤毛分化及摆动频率的影响，为在现有培养模式下改进技术得到能够诱导纤毛分化的有效培养方法奠定了基础。

[关键词] 呼吸道上皮细胞；纤毛摆动频率；培养模式；纤毛分化

[中图分类号] R56 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2016）03（b）-0040-04

[Abstract] Respiratory epithelial cell plays an important role in the development of respiratory diseases. The respiratory epithelial surface of mammalian airway were covered with cilia. The beat of the cilia can protect the respiratory system from bacteria， virus and other harmful factors. Therefore， cilia beat frequency （CBF） became a crucial element of regulating the progress of many kinds of respiratory diseases. It can be used to research inflammation， smoke， infection and respiratory tumor. The technologies of respiratory epithelial cell culture and separation of epithelium in vivo were applied to research CBF. These culture methods， however， had many problems which include low differentiation of cilia and many mixed cells. With the culture mode developed continuously， this paper focused on the major culture mode of respiratory epithelial cells and the culture methods which were improved constantly under relevant culture mode. It also summarized the detection of differentiation of cilia and the CBF， defined the influence on the culture cycle， culture process， especially the differentiation of cilia which were subject to the culture mode， laid the foundation of improving the technology of respiratory epithelial cell culture.

[Key words] Respiratory epithelial cells； Cilia beat frequency； culture mode； Cilia differentiation

呼吸道上皮是呼吸系统的重要组成部分，是抵御外界环境中细菌、病毒、小分子粉尘等有害危险致病因素的首道防线，一旦呼吸道上皮受到损伤，各种有害微生物以及其他危险致病因素很快就侵入到下呼吸道，直接引发各类急性呼吸系统疾病，除此之外，在失去具有正常功能的呼吸道上皮保护下，危险致病因素也可对呼吸系统深部组织呈现慢性刺激，导致发生诸如慢性阻塞性气道疾病、肿瘤、硅肺、慢性气道炎症等各类呼吸系统慢性疾病的可能性升高。呼吸道上皮组织学结构主要由包括以呼吸道上皮细胞为主的各类细胞所构成，在鼻黏膜以及诸如气管、主支气管、段支气管等呼吸道，呼吸道上皮层被密集的纤毛所覆盖，这主要是由于构成呼吸道上皮的气道上皮细胞多为具有纤毛分化能力的纤毛上皮细胞，覆盖在细胞表面的纤毛摆动可以保护深部呼吸系统免于各类细菌、病毒、粉尘、烟雾的在呼吸道的滞留引发的慢性损伤，同时纤毛的定向节律运动也可以推动呼吸道分泌黏液排除体外[1-2]，纤毛的摆动快慢及其密度与呼吸道的黏液运输系统密切相关[3]，纤毛每秒的摆动次数称之为纤毛摆动频率（CBF），是判断呼吸道上皮纤毛排除异物，保护呼吸系统的重要指标之一，CBF的调控是许多呼吸系统疾病的关键因素，其中研究发现钙离子在调节纤毛运动中被认为发挥了很大的作用[4]，同时在临床上也有研究表明鼻部药物的给药方式及药物溶解方式对CBF的影响很大[5]，在过敏性鼻炎的急性期，组胺能够调节呼吸道纤毛的摆动频率[6]，近期也有研究表明，生物的年龄是影响呼吸道上皮纤毛摆动的一个重要因素，且受到蛋白激酶Cε（PKCε）的调节[7]。因此，基于以上原因，在体外构建呼吸道上皮细胞纤毛摆动模型显得至关重要，体外研究呼吸道上皮细胞以及CBF的方法主要是借助于呼吸道上皮细胞的原代培养以及活体急性分离呼吸道组织体外培养，但由于呼吸道上皮细胞的培养本身具有杂细胞多，细胞培养周期短，细胞表面不易分化纤毛等特点，随着其培养模式不断发展，众多学者不断探索更好的培养模式，以便于培养的细胞纯度以及细胞功能与在人体呼吸道的上皮细胞更具相似性，能够更好地分化纤毛，观测到纤毛的摆动，检测到CBF。至今为止，关于呼吸道纤毛上皮细胞的培养模式的研究并不多，本文简述了呼吸道上皮细胞两种主要的原代培养模式及各自的主要培养方法及改进发展情况，同时介绍并总结了呼吸道上皮细胞纤毛分化的鉴定及其摆动频率的检测，明确了各类培养模式对操作流程、培养周期，尤其是纤毛分化及摆动频率的影响，为在现有培养模式下改进技术得到能够诱导纤毛分化的有效培养方法奠定了基础。

1 呼吸道上皮细胞的原代培养模式

虽然在以往的研究中众多学者建立的培养方式有很多，但根据其培养原理的差异性，呼吸道上皮细胞的培养可以归纳起来分为两大类，一类是借助呼吸道组织活性，利用快速处理过的急性分离的呼吸道组织，培养呼吸道细胞，这类方法的特点是爬出的细胞具有高度的组织活性，根据技术手段的不同，操作时间一般在数十分钟至两小时之内，但根据处理方式及培养条件的各异，培养的上皮细胞可能含有较多的杂细胞甚至杂细胞含量过高抑制了上皮细胞的生长，这一类方法可归纳为活性组织培养模式。另一类培养模式是借助不同种类的蛋白酶将呼吸道上皮表面的细胞从呼吸道骨架上消化下来，将消化下来的细胞处理后重悬浮培养，这一类培养方法由于采用了各种不同的蛋白酶，气道上皮细胞的活性受到了破坏，细胞的分化功能会受到损伤，细胞的纯度也会根据所使用酶的种类不同也有所区别，且细胞培养周期一般较长，操作过程根据酶消化的条件不同可达2～24 h不等，这一类方法被归纳为酶消化细胞培养模式，也是目前报道较多的一类培养模式。

1.1 酶消化细胞培养模式

酶消化细胞培养是首例呼吸道上皮细胞原代培养，其上皮组织取材来源于人的主支气管，研究者利用型蛋白酶溶解在磷酸盐缓冲液中，在4℃环境下对主支气管的上皮细胞进行消化，消化时间为24 h，结果通过透射电镜与免疫组化等方法对培养的细胞的纤毛分化进行检测，该方法培养的气道上皮细胞纤毛分化较好，但由于过夜消化使得操作时间较长，且消化的细胞贴壁生长不好，对细胞的纤毛分化功能有一定的影响[8]。在此培养模式的基础上，众多学者在操作流程及培养材料及细节上进行了修改，有学者使用人的主支气管以及小鼠的鼻黏膜作为取材来源，同时采用了改良的气液相联合培养的方法，在使用相似的蛋白酶消化后，将消化下的细胞离心后重悬浮置于气液相培养皿装置中，该装置模拟哺乳动物气道上皮层的生理解剖学环境，装置中加入适量的上皮细胞培养基，使得细胞浸没在含有上皮细胞培养基的溶液中，而同时又可以暴露在空气环境中，这种模拟人体气道上皮层的气液相环境可以有效地在体外刺激并诱导上皮细胞的纤毛分化[9-10]。近期又有国内学者利用类似的方法使用特殊培养基和鼠尾胶原包被的培养器皿成功培养了人鼻黏膜以及小鼠呼吸道上皮细胞，并详细记录了其生长情况，同时使用免疫组化和高速数码摄像机检测了纤毛的分化，培养的上皮细胞的CBF对ATP刺激的反应性很好，特殊培养基和胶原包被的培养器皿可以增强上皮细胞的贴壁能力，对细胞的生长和分化起到促进作用[11-13]。不仅如此，该方法在改进后还可以建立纤毛运动障碍模型，用以研究原发性纤毛运动障碍（primary ciliary dyskinesia，PCD）等疾病[14]。气液相培养结合酶消化细胞培养模式可以在体外快速获取大量上皮细胞并且容易建立细胞的生长以及细胞表面纤毛分化的模型，但该方法培养的上皮细胞的纤毛分化也能受到多种因素的调控，有学者发现诸如4-Methylnitrosamino-1-3-pyridyl-1-butanone（NNK）的化学试剂对于体外气液相培养气道上皮具有重要的调控作用，能在短时间内影响细胞的正常生长与纤毛分化[15]，以上这些研究也为如何精准调控体外酶消化法培养的细胞生长及纤毛分化垫定了基础。

1.2 活性组织培养模式

运用活性组织法培养模式的学者最早可追溯到1995年Dirksen ER，在他的研究中采用了分离的活性气道上皮组织，并依靠其组织活性进行体外培养，同时使用鼠尾胶原作为其培养的铺垫底物，利用了特殊的上皮细胞培养基，成功在体外培养出呼吸道上皮细胞，该方法虽然能获得大量气道上皮细胞，但操作过程繁琐且精细，需要在显微操作下完成气道上皮层的分离，培养者在一定的训练后方能完成[16]。国内部分学者在此方法的基础上加以改进，分别从兔、人的主支气道及鼻黏膜取材，使用鼠尾胶原包被培养器皿，将有活性的气道上皮组织或鼻黏膜组织剪碎，使其固定在培养器皿上，在培养的第4～7天，上皮细胞爬出并融合，可观察到纤毛分化及稳定的节律性摆动[17-18]，研究者同时对纤毛的特定标记蛋白黏蛋白5AC（mucin-5AC，MUC5AC）进行了检测，其表达呈阳性，扫描电镜也可以观察到浓密的纤毛分化[19]，充分肯定了这种培养模式可成功诱导有纤毛分化的细胞从组织周围爬出。在近期，又有学者比较了采用呼吸道组织体外直接种植培养以及在体外培养后将组织分离开，发现前者培养的气道上皮细胞纤毛分化丰富，但后者纤毛分化较少，细胞在第7～10天时生长达到最佳状态，且二者分化的纤毛摆动频率也较好，且对ATP的刺激反应性也均较好[20]，这些研究为如何在体外选择性构建研究所需要的模型提供了基础；与此同时，研究者检测了纤毛上皮细胞的特定标志物β-tubulin Ⅳ以及ZO-1的表达，表达呈阳性，结果显示了培养的细胞纤毛分化丰富，且密度较高。活性组织培养成功的关键主要在于取材的离体组织上皮活性是否完好，组织取下后能否在显微镜下直接观察到组织上纤毛的摆动；除此以外，培养器皿的胶原包被、特殊培养基的使用，这些都是诱导具有纤毛分化细胞爬出的关键因素。

2 呼吸道上皮细胞的纤毛分化

在通过以上培养模式获取了大量的呼吸道上皮细胞或是活体取出了具有纤毛的气道组织后，要检测细胞的纤毛分化或组织的纤毛分化情况，目前常用的检测方法包括免疫组织化学检测上皮细胞特定蛋白表达、扫描电子显微镜（SEM）观察细胞或组织表面纤毛的生长密度及高度，以及采用高速显微摄像技术观察CBF并直接记录纤毛摆动情况。免疫组织化学法检测的特定标记蛋白主要包括前面所提到的β-tubulin Ⅳ以及mucin-5AC，这两种蛋白为纤毛上皮细胞所特定的表达，而ZO-1则是用来反映上皮细胞融合程度的标志物，除此以外，角蛋白也可以作为上皮细胞的特定表达蛋白用以检测细胞的生长情况。SEM则可以通过扫描上皮细胞表面或气道组织表面的超微结构，直接观察上皮细胞或组织表面纤毛的生长情况，但SEM样本的制样过程繁琐，且样本经固定脱水后，细胞及表面的纤毛均已死亡，不能在活体状态下反映出纤毛的运动状态。相比之下，高速显微摄像技术则可以让研究人员通过连接高速电荷耦合元件（CCD）的显微镜，并通过可视化的视频分析软件直接地观察到纤毛的摆动，是判断细胞纤毛分化以及检测CBF最直接可靠的方法，然而由于哺乳动物CBF较快，且不同种属来源的呼吸道上皮纤毛摆动有所区别，小鼠的摆动频率最高，而人的相对较慢，但均高达8～15次/s，因此需要使用专门的仪器设备以及软件系统才可以记录并检测其摆动频率。随着呼吸道上皮细胞培养模式的发展以及光学数码显微技术的进步，纤毛摆动的记录及检测方法也不断发生变化。在记录纤毛高速摆动时，高速影像系统是记录纤毛高速摆动所必须的，为保证其客观提交相同，其记录条件一般在标准体内温度37℃，将细胞或组织浸没在磷酸盐缓冲液中；而影像系统的采集帧数多为60～100帧/s，这样可以保证上皮细胞纤毛的有效摆动均被记录下来[21]。对于采集的图像信息，利用Hcimage等图像分析软件，详细分析纤毛摆动区域的灰度值，由于纤毛的定向节律摆动，引起了区域内灰度值的变化，因此通过分析单位时间帧数内灰度曲线的周期变化情况，可以准确地反映出纤毛每秒摆动的次数[22]。

3 小结与展望

呼吸道上皮的纤毛摆动及其调控和呼吸道黏液运输、临床给药以及多种呼吸系统重大疾病的发生发展均具有密不可分的关系，在体外构造简便快速可靠的培养模式以诱导气道上皮细胞的纤毛分化并检测其摆动频率在分析气道上皮细胞功能上显得至关重要。但由于气道上皮细胞培养以及检测的复杂性，目前对这方面的研究相对较少，在目前主要的两种培养模式下，操作流程及培养周期均较长，但各自的操作流程及对诱导细胞纤毛分化的能力均各具特点，最可靠的检测方法主要是通过连接高速CCD的显微镜直接记录纤毛摆动情况并间接分析纤毛摆动导致的图像灰度变化从而计算CBF。但随着细胞生物学以及光学显微摄像技术的进一步发展，在未来，将会探索出更加便捷可靠的培养模式，为研究呼吸系统重大疾病、寻找呼吸道上皮纤毛摆动参与的呼吸系统疾病的发病机制奠定基础。

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（收稿日期：2015-11-30 本文编辑：赵鲁枫）