多年生黑麦草LpGCS基因克隆及其在烟草中的初步功能验证

魏树强，孙振元，代小梅，钱永强

(中国林业科学研究院林业研究所，国家林业局林木培育重点实验室，北京100091)



多年生黑麦草LpGCS基因克隆及其在烟草中的初步功能验证

魏树强，孙振元*，代小梅，钱永强

(中国林业科学研究院林业研究所，国家林业局林木培育重点实验室，北京100091)

摘要：本研究以多年生黑麦草‘高帽2号’叶片为试材，根据同源基因的CDS序列设计简并引物，采用RT-PCR和RACE技术，克隆了多年生黑麦草γ-谷氨酰基半胱氨酸合成酶基因LpGCS。该基因全长为1674 bp(GenBank登录号：KJ551844)，具有完整的开放阅读框(ORF)，共1125 bp；对其氨基酸序列特性、结构以及与其他8种同源基因氨基酸序列间的同源性进行了研究，预测该蛋白分子量为42.86 kDa，属于不稳定类蛋白质，其蛋白质二级结构以α-螺旋为主；蛋白质氨基酸序列与其他8种同源基因氨基酸序列间同源性都比较高；此外，成功构建了该基因的正、反义植物表达载体pCAMBIA-Ubi-LpGCS+和pCAMBIA-Ubi-LpGCS-，并通过农杆菌介导法获得转正、反义基因烟草。对转基因植株和野生型烟草进行镉离子胁迫试验，生理生化指标测试结果表明镉离子胁迫处理10 d后，转LpGCS+植株中MDA含量低于野生型，光合色素含量与POD、SOD、CAT活性均高于野生型；而转LpGCS-植株中MDA含量高于野生型，光合色素含量与POD、SOD、CAT活性均低于野生型。综上所述，LpGCS基因在烟草中的过量表达可以提高植株的耐镉胁迫能力，为进一步利用该基因转化多年生黑麦草培育抗重金属植株奠定基础。

关键词：多年生黑麦草；γ-谷氨酰基半胱氨酸合成酶；基因克隆；功能验证

在植物抗氧化系统中，谷胱甘肽(glutathione， GSH)是植物应对活性氧引起的氧化破坏中最为重要的细胞内物质，其在硫的运输调控、信号转导、代谢物质的结合、外源化学物质的解毒[1]和一些植物悬浮培养细胞和叶片中胁迫响应基因(例如，PR1，GST，GPX，CHS，PAL，SOD等)的表达中起到了重要的调控作用[2]。谷胱甘肽是植物螯合肽合成的底物[3-4]，在低温、重金属、氧化等环境胁迫下，GSH的积累水平随着胁迫时间延长而增加[5-6]，而植物螯合肽富含Cys，通过其巯基与金属结合而形成硫醇盐，能够提高植物对重金属的抗性，解除重金属对植物的毒害作用，并维持细胞内环境中金属离子浓度的相对稳定[3,7-9]。因此，通过在植物中过量表达GSH合成相关基因能够提高植物对非生物胁迫的抗性。

谷胱甘肽的合成是以氨基酸和ATP为底物，在γ-谷氨酰基半胱氨酸合成酶(γ-glutamylcysteine synthetase，γ-ECS)和谷氨酸合成酶(GSH synthetase，GS)催化条件下完成的，其中γ-谷氨酰基半胱氨酸的合成是谷胱甘肽合成过程中的限速步骤[3]。在烟草(Nicotianatabacum)[10]、番茄(Lycopersiconesculentum)[11]、豌豆(Pisumsativum)[12]和水稻(Oryzasativa)[13]中过量表达γ-ECS或GS基因，能够提高它们对非生物胁迫的抗性，并且其体内谷胱甘肽的含量决定了其对逆境的抵抗能力，而当谷胱甘肽合成被抑制时，高山离子芥(Chorisporabungeana)愈伤组织对冷害的抵抗能力下降[14]。

在重金属胁迫下，草坪草的生长受到显著抑制[15]。本研究以多年生黑麦草(Loliumperenne)为材料，利用γ-谷氨酰基半胱氨酸合成酶(又称作谷氨酸半胱氨酸连接酶，GCS)基因的同源保守序列设计简并引物，采用RACE(rapid-amplification of cDNA ends)法克隆了GSH合成的关键酶基因，对其进行生物信息学分析及预测，并利用农杆菌介导法转化烟草验证该基因的功能，为进一步培育具有抗重金属等非生物胁迫特性的多年生黑麦草新种质资源奠定良好基础。

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1植物材料将多年生黑麦草‘高帽2号’成熟种子播种于中国林业科学研究院温室大棚，2个月后取其新鲜叶片作为总RNA提取的实验材料，用液氮速冻，置于-80℃超低温冰箱保存。

1.1.2菌株和载体普通连接载体pEASY-T3 Cloning Kit和感受态trans1-t1(Trans1-T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell)均购自北京全式金生物技术有限公司。载体pCAMBIA1301-Ubi、根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌种EHA105均由本实验室保存。

1.1.3主要生化试剂Qiagen RNeasy MiNi Kit(50)、DNase I、TakaRa LA Taq DNA 聚合酶、EcorI、Kpn I、QuickCut BamH I、T4DNA连接酶、SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit均购自TaKaRa 公司。QuantScript RT Kit、D2000 DNA Marker、普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、质粒小提试剂盒购自北京天根科技有限公司。寡核苷酸引物合成和所克隆基因片段测序均由北京华大生物技术有限公司完成。

1.2试验方法

1.2.1总RNA的提取与cDNA第一链的合成采用Qiagen RNeasy MiNi Kit(50)RNA提取试剂盒(TaKaRa 公司)提取多年生黑麦草叶片总RNA。经DNase I(TaKaRa 公司)处理后，利用NanoDrop8000检测在260，280及230 nm处的吸光值，确定总RNA的纯度及浓度，利用1.2%的琼脂糖电泳检测总RNA的完整性。检测获得的高质量总RNA，在Quant Reverse Transcriptase的作用下，以Oligo(dT)15为引物进行反转录，合成cDNA第一链(QuantScript RT Kit试剂盒，天根)，-20℃保存备用。

1.2.2LpGCS中间片段的克隆根据GenBank上已注册的印度芥菜(Brassicajuncea)(AJ005587.1)、小麦(Triticumaestivum)(AY864064.1)、日本水稻(O.sativaJaponica Group)(AJ508916.2)、玉米(Zeamays)(AJ302783.1)、芦苇(Phragmitesaustralis)(FJ463872.1)GCS基因的CDS序列设计简并引物LpGCS-Z51[5′-T(T/C)GAAACATTACATCAAACTTGTGC-3′]和LpGCS-Z31[5′-ACCAACCTCCTTGTA(T/C)CCTCTTC-3′]进行PCR扩增。PCR扩增参数为94℃ 3 min，94℃ 30 s，52℃ 30 s，72℃ 2 min；30次循环。回收目的片段分别连接到pEASY-T3克隆载体，并转化至Trans1-T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell，取阳性克隆进行菌液PCR、酶切鉴定并测序。

1.2.3LpGCS5′端和3′端的克隆根据测序得到的序列信息设计RACE引物LpGCS-S51(5′-CCCTTGGGCATTATTGGTATCTCACTC-3′)和LpGCS-X31(5′-GTCGGGTTGCTGTATGATGAGGAGT-3′)，使用SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit所提供的UPM引物(5′-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3′)经PCR获得两端片段序列。PCR扩增参数为94℃ 3 min，94℃ 30 s，68℃ 30 s，72℃ 2 min，25个循环。

1.2.4LpGCS全长的克隆将获得的基因序列进行拼接，在NCBI网站进行比对，确认为目的基因序列后，利用NCBI网站上的ORF Finder软件获取ORF序列，在ORF ATG前设计5′端特异引物LpGCS-51(5′-AAGGAGAACTGGAGAATCGGCACA-3′)，ORF 3′端TAG之后设计3′序列保守区引物LpGCS-31(5′-GCCGCAAGACCAGAAGGAAGT-3′)。PCR扩增参数为94℃ 3 min，94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 2 min，30个循环。PCR产物经回收、连接、转化、菌斑PCR、酶切检测鉴定和测序。

1.2.5序列分析利用NCBI网站Protein Conservation Domain程序对LpGCS编码的蛋白质序列进行蛋白质保护域和保守性分析；利用在线软件ExPASyProtParam tool(http://www.expasy.org)预测基因所编码蛋白质的氨基酸组成、分子量、理论等电点，利用SOPMA(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat. pl?page=npsa_sopma.html)预测其蛋白质二级结构。

1.2.6植物表达载体的构建首先对基因全长和载体进行酶切位点分析，选择目的基因内部没有相应酶切位点的酶BamH I和Kpn I，在目的基因上游PCR引物5′端加上BamH I酶切位点，设计构建正义载体所用上游引物ZB(5′-GGATCCATGGAAGAAGGCCATG-3′)；在下游PCR引物5′端加上Kpn I酶切点，设计构建正义载体所用下游引物ZK(5′-GGTACCTCAGTATAACAATTCCTCGA-3′)；在上游PCR引物5′端加上Kpn I酶切位点，设计构建反义载体所用上游引物FK(5′-GGTACCATGGAAGAAGGCCATGT-3′)；下游PCR引物5′端加上BamH I酶切位点，设计构建反义载体所用下游引物FB(5′-GGATCCTCAGTATAACAATTCCTCGA-3′)。用携带LpGCS基因的T载体质粒作为模板进行PCR扩增，PCR扩增参数为94℃ 3 min，94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 2 min，30个循环。对扩增产物进行胶回收，重新连接到pEASY-T3载体上，经转化、过夜培养、质粒DNA酶切、测序，确定获得含酶切位点的目的基因正、反义片段，分别将其连接入pCAMBIA1301-Ubi植物表达载体上，经双酶切鉴定目的基因的正反义植物表达载体是否构建成功。

1.2.7叶盘法转化烟草及抗性植株的筛选制备根癌农杆菌EHA105感受态细胞，利用获得的无菌、生长良好的‘珊西’烟草幼苗(无菌培养30 d)叶盘进行转化。将剪好的烟草叶盘在含目的基因的农杆菌液中侵染15 min，用无菌滤纸吸干液体后，将侵染后的叶盘置于铺有一层无菌滤纸的MS培养基(MS+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IAA， pH 5.8)上黑暗条件下28℃共培养2 d后，将叶盘转入含有抗生素的再生培养基(MS+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IAA+500 μg/mL Carb+50 μg/mL Kan，pH 5.8)进行分化培养，以未转化的烟草叶盘作对照；待再生芽长至2 cm高时，切下移入生根培养基(MS+200 μg/mL Carb+75 μg/mL Kan，pH 5.8)诱导生根；3周后获得再生植株；继续培养30 d后，去封口膜，室内炼苗3～5 d后，移栽至营养土∶草炭∶蛭石(3∶1∶1)花盆中培养，然后置于温室常规管理。

1.2.8转基因植株的分子检测采用Trizol法提取抗性烟草植株和野生型烟草的总RNA，反转录成cDNA第一链后，利用引物ZB(5′-GGATCCATGGAAGAAGGCCATG-3′)、ZK(5′-GGTACCTCAGTATAACAATTCCTCGA-3′)和FK(5′-GGTACCATGGAAGAAGGCCATGT-3′)、FB(5′-GGATCCTCAGTATAACAATTCCTCGA-3′)进行RT-PCR扩增鉴定转基因烟草植株。以烟草NtActin为内参，NtActinF引物(5′→3′)：TAGTAAGCAACTGGGACG，NtActinR引物(5′→3′)：CTCTGAGCCAATGGTAAT。

1.2.9T0代烟草表型观测对野生型烟草和转基因烟草的生长状况进行观察。2个月后，分别随机选取8株野生型烟草(CK)和 T0代阳性正、反义转基因株系进行株高测量。

1.2.10转正、反义LpGCS烟草耐镉胁迫试验设计实验在中国林业科学研究院科研温室内进行。正、反义转基因烟草和野生型烟草植株由无菌苗移栽于温室草炭土基质中，常规养护管理。生长2个月后，随机选取野生型烟草(CK)和T0代阳性正反义转基因株系(L+、L-)进行重金属Cd2+处理，Cd2+由CdCl2·2.5H2O(分析纯)提供。处理液CdCl2溶液浓度为5 mg/L，每3 d浇灌1次。每处理3次重复。分别在处理0和8 d后测定野生型烟草(CK)和T0代阳性正反义转基因株系(L+、L-)的光合色素含量、丙二醛含量、抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性、过氧化物酶(POD)活性和过氧化氢酶(CAT)活性，参照刘俊祥[16]的方法测定。选取烟草同一部位上生长叶龄相似的叶子，取样时间为早晨 8:00-9:00，每个株系3个重复。

1.3统计分析

利用Excel 2007进行数据整理、标准差的计算和作图，利用SPSS 13.0进行Duncan多重对比。

2结果与分析

图1　LpGCS克隆电泳图　　Fig.1　Agarose gel electrophoresis for the clone of LpGCS　　　A：中间片段PCR产物；B：5′端酶切产物；C：3′端酶切产物；D：基因全长酶切产物； M：Marker(D2000)；1：PCR产物；2，3，4：酶切产物。A:The product of middle sequence; B:The digested product of 5′ sequence; C: The digested product of 3′ sequence; D: The digested product of full-length sequence; M: DNA Marker (D2000);1:Product of PCR; 2,3,4:The digested product.

2.1LpGCS中间片段的克隆

从多年生黑麦草叶片中提取，获得高质量总RNA，利用设计的引物进行中间片段扩增，琼脂糖凝胶电泳结果如图1A所示，获得约900 bp大小的核苷酸序列，与预计目的条带大小相符；经胶回收、载体连接、转化，挑取阳性克隆、摇菌过夜，经菌落PCR，选取携带目的条带的阳性克隆菌液进行测序，获得长911 bp的核苷酸序列。将测序获得的cDNA核苷酸序列，用Blast软件将其与GenBank中的所有序列进行同源性比对，发现其与小麦、高粱γ-谷氨酰基半胱氨酸合成酶的一致性约在91%，与日本水稻、玉米的一致性为90%，并初步确定其为GCS2超级家族基因序列的一部分。这表明已经从多年生黑麦草叶片中分离出γ-谷氨酰基半胱氨酸合成酶基因的中间片段。

2.2LpGCS5′端和3′端的克隆

根据已获得的中间片段核苷酸序列，设计特异性引物LpGCS-S51进行5′RACE PCR扩增，如图1B，获得403 bp的DNA片段。扩增产物经胶回收、载体连接、转化，挑取阳性克隆、摇菌过夜后，提取质粒DNA并酶切，将具有单一目的条带的阳性克隆菌液送交公司测序。在NCBI网站上用Blast软件将测序结果与GenBank中的所有序列进行同源性比对(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastx&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome)，发现其与二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)的一致性达到91%，与印度水稻、日本水稻、玉米、短花药野生稻γ-谷氨酰基半胱氨酸合成酶的一致性都达到了88%，并初步确定其为GCS2超级家族基因序列的一部分。以上结果表明已从多年生黑麦草中获得了目的基因的5′端片段。

根据已获得的中间片段核苷酸序列，设计特异性引物LpGCS-S31进行3′RACE PCR扩增，如图1C，获得约750 bp的DNA片段。扩增产物经胶回收、载体连接、转化，挑取阳性克隆、摇菌过夜，提取质粒DNA并酶切，选取携带单一目的条带的阳性克隆菌液进行测序。在NCBI网站上用Blast软件将测序结果与GenBank中的所有序列进行同源性比对，发现其与小麦、日本水稻、玉米、乌拉图小麦、芦苇γ-谷氨酰基半胱氨酸合成酶的一致性都在90%以上，并初步确定其为GCS2超级家族基因序列的一部分。

2.3LpGCS的全长克隆

利用DNAMAN软件将克隆得到的LpGCS中间片段、3′端和5′端核苷酸序列进行拼接，获得了全长为1674 bp的核苷酸序列。为检验拼接是否准确，设计了基因的特异引物LpGCS-31和LpGCS-51，如图1D，PCR扩增出约1400 bp的条带，将PCR产物回收、连接、测序，获得长为1398 bp的核苷酸序列， 经测序发现与拼接结果一致。 对LpGCS全长进行分析， 如图2所示，发现LpGCS全长包含一个长度为1125 bp的开放阅读框(openg reading frame)，在145～1269 bp之间，推测编码374个氨基酸；5′非翻译区长144 bp，3′非翻译区长405 bp。多年生黑麦草LpGCS基因在GenBank上获得的核苷酸序列的登录号为：KJ551844。

图2　LpGCS全长核苷酸与氨基酸序列Fig.2　The full-length sequence of cDNA nucleotide and amino acid for LpGCS

图3　LpGCS蛋白质二级结构模型预测Fig.3　Secondary structure prediction models of LpGCS protein

将获得的LpGCS的核苷酸序列在NCBI上经BLAST分析发现，得分靠前的有小麦γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶(GSH1)mRNA全长序列、二穗短柄草γ-谷氨酰基半胱氨酸连接酶B mRNA序列、日本水稻γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶基因mRNA序列、芦苇γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶(GCS)mRNA全长序列，LpGCS的核苷酸序列与它们的一致性都达到了88%以上，说明该基因属于谷氨酸半胱氨酸连接酶家族2(glutamate-cysteine ligase family 2，GCS2)，也被称为γ-ECS，其催化谷胱甘肽从头生物合成的第一步反应，是谷胱甘肽合成的限速酶。

图4　LpGCS所编码氨基酸序列与其他8个物种同源氨基酸序列间的比对Fig.4　Homologous comparison of the deduced amino acid sequences of LpGCS with other 8 species

At：拟南芥Arabidopsisthaliana；Bd：二穗短柄草Brachypodiumdistachyon；Bj：印度芥菜Brassicajuncea;；Lj：百脉根Lotusjaponica；Lp：多年生黑麦草Loliumperenne；Nt：烟草Nicotianatabacum；Os：日本水稻OryzasativaJaponica Group；Ta：小麦Triticumaestivum；Zm：玉米Zeamays.

2.4LpGCS编码蛋白质性质与结构分析

LpGCS所编码蛋白质含有374个氨基酸，其亲水性氨基酸占氨基酸总量的30.2%，疏水氨基酸占43.4%，碱性氨基酸占总氨基酸的12.8%，酸性氨基酸占总氨基酸含量的13.6%，其分子式为C1933H2986N510O555S19，推测其分子质量为42859.2 Da， 理论等电点pI=5.39； 不稳定系数为47.63，属于不稳定类蛋白质。如图3所示，LpGCS所编码蛋白由46.26%的α-螺旋(alpha helix)、35.29%的无规则卷曲(random coil)、12.83%的延伸主链(extended strand)和5.61%的β-转角组成，由此看出，α-螺旋是LpGCS蛋白的主要组成部分，其他二级结构则散布LpGCS蛋白α-螺旋结构之间。

图5　基于GCS基因所编码氨基酸序列9个物种的系统发生树Fig.5　Phylogenetic tree based on amino acid sequences coding by GCS gene of 9 species

图6　pEASY-T3-LpGCS正义、反义载体和pCAMBIA1301-Ubi载体的Kpn I、BamH I双酶切电泳Fig.6　The sense/anti-sence of pEASY-T3-LpGCS and pCAMBIA1301-Ubi were digested with Kpn I and BamH I　　　M1：Marker DM10000；M2：Marker D2000；1：pCAMBIA1301-Ubi质粒对照；2：pCAMBIA1301-Ubi质粒双酶切产物；3：pEASY-T3-LpGCS+质粒对照；4：pEASY-T3-LpGCS+质粒双酶切产物；5：pEASY-T3-LpGCS-质粒对照；6：pEASY-T3-LpGCS-质粒双酶切产物。1: CK of pCAMBIA1301-Ubi plasmid; 2: Product after pCAMBIA1301-Ubi plasmid was digested with Kpn I and BamH I; 3: CK of pEASY-T3-LpGCS+ plasmid; 4: Product after pEASY-T3-LpGCS+ plasmid was digested with Kpn I and BamH I; 5: CK of pEASY-T3-LpGCS- plasmid; 6:Product after pEASY-T3-LpGCS- plasmid was digested with Kpn I and BamH I.

2.5LpGCS蛋白同源性分析

将LpGCS的核苷酸序列翻译成氨基酸序列，提交NCBI并进行在线比对(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，发现其与小麦γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶、二穗短柄草γ-谷氨酰基半胱氨酸连接酶B、芦苇γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶序列一致性最高，达95%。如图4所示，选择与其氨基酸序列一致性较高和具有代表性的8个物种的氨基酸进行比对，发现该基因N端具有很强的保守性。

利用MEGA 4.0 版本 Kimura 双参数模型，NJ法构建进化树，结果如图5所示，发现多年生黑麦草LpGCS基因所编码蛋白质氨基酸序列与同为禾本科小麦同源性最高，与拟南芥和印度芥菜的同源性最低。

图7　pCAMBIA-Ubi-LpGCS正义和反义载体Kpn I和BamH I双酶切检测电泳Fig.7　The sense/anti-sence of pCAMBIA-Ubi-LpGCS were digested with Kpn I and BamH I　　　M：Marker DM10000；1：pCAMBIA-Ubi-LpGCS质粒对照；2：pCAMBIA-Ubi-LpGCS+质粒双酶切产物；3：pCAMBIA-Ubi-LpGCS-质粒双酶切产物。1:CK of pCAMBIA-Ubi-LpGCS plasmid;2: Product after pCAMBIA-Ubi-LpGCS+plasmid was digested with Kpn I and BamH I;3: Product after pCAMBIA-Ubi-LpGCS- plasmid was digested with Kpn I and BamH I.

图8　7个转LpGCS+基因株系和4个转LpGCS-基因株系的RT-PCR检测结果 Fig.8　RT-PCR analysis of 11 transformed lines

图9　转LpGCS+/-烟草和野生型(CK)生长2个月后株高对比Fig.9　The comparison of height for wild type tobacco and transgenic tobacco with LpGCS +/-　　　不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)；不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，下同。The different capital letters mean very significant differences at P<0.01; The different small letters mean significant differences at P<0.05， the same below.

2.6LpGCS基因正、反义植物表达载体的构建

为构建LpGCS基因正、反义植物表达载体，首先分别构建pEASY-T3-LpGCS正义和反义载体。经PCR扩增获得LpGCS的正义基因片段(5′与3′端加有酶切位点Kpn I、BamH I)和反义基因片段(5′与3′端加有酶切位点BamH I、Kpn I)，分别与克隆载体先后经过Kpn I、BamH I酶切的IpEASY-T3大片段连接，经转化、涂板、挑单克隆、摇菌后，提取质粒，分别再利用Kpn I、BamH I对含目的基因的重组载体pEASY-T3-LpGCS+和pEASY-T3-LpGCS-进行质粒双酶切，电泳结果如图6所示，从克隆载体pEASY-T3上分别切下带酶切位点的长约1.1 kb的正反义基因片段。

同时，利用Kpn I对pCAMBIA1301-Ubi载体进行单酶切，1.2%琼脂糖凝胶电泳后，对酶切产物进行回收，用BamH I对回收产物再次进行酶切，如图6，获得pCAMBIA1301-Ubi载体大片段；将上一步胶回收获得的带酶切位点的正、反义基因片段分别与胶回收获得的pCAMBIA1301-Ubi载体大片段连接，经转化、涂板、挑单克隆、摇菌后，提取质粒，分别再用Kpn I、BamH I对含目的基因的重组载体pCAMBIA1301-Ubi-LpGCS+和pCAMBIA1301-Ubi-LpGCS-进行质粒双酶切，电泳结果如图7所示，检测发现1.1 kb左右的条带，将阳性克隆送交华大公司测序，DNA 测序结果与目的基因序列一致，这表明LpGCS的正反义植物表达载体构建成功。

2.7转基因植株的分子检测

农杆菌侵染后的烟草叶盘，在抗性培养基上经过分化再生形成抗性植株。据统计，抗性筛选共获得7株转正义基因植株和4株转反义基因植株。采用Trizol法提取所有抗性烟草植株和野生型烟草的总RNA，反转录成cDNA第一链后，利用引物ZB、ZK和FK、FB进行RT-PCR扩增，以烟草NtActin为内参，鉴定抗性转基因植株。如图8所示，转基因烟草扩增出1 条约为1100 bp的LpGCS片段，而野生型对照无此条带，由此筛选出5个转正义基因阳性株系和3个转反义基因阳性株系，表明LpGCS在转录水平正常表达。

2.8T0代烟草表型观测

RT-PCR检测为阳性的正反义转基因烟草经过扩繁后，进行常规养护管理，均能够正常生长。2个月后， 随机分别选取8株野生型烟草(CK)和 T0代阳性正、反义转基因株系进行株高测量，发现转LpGCS+基因烟草的平均高为(32.1±2.5) cm，显著高于转LpGCS-烟草和对照(图9)，且转LpGCS+烟草提前进入花期，而转LpGCS-烟草和对照均未开花(图10)，这可能是因为LpGCS+的过量表达促进了转基因烟草的生长和发育。

图10　生长2个月的转LpGCS+/-烟草和野生型(CK)植株Fig.10　Two months of wild type and transgenic tobacco with LpGCS+ and LpGCS-　　　A：2个月后3种类型的烟草的生长状况The growing condition of 2 months for three types of tobacco；B：转LpGCS+烟草已形成的花序The forming inflorescence of transgenic tobacco with LpGCS+.

2.9转正、反义LpGCS烟草耐镉胁迫能力鉴定

分别在处理0和8 d后测定野生型烟草(CK)和T0代阳性正反义转基因株系(L+、L-)的光合色素含量、丙二醛含量、抗坏血酸过氧化物酶活性、过氧化物酶(POD)活性和过氧化氢酶(CAT)活性。结果表明，胁迫前转LpGCS-烟草植株中光合色素的含量显著低于野生型(图11A)，且于胁迫处理后，与野生型植株光合色素的含量均低于转LpGCS+烟草；胁迫处理后的转LpGCS+烟草MDA含量显著低于野生型与转LpGCS-烟草(图11B)，表明其膜系统所受伤害小；胁迫处理后的LpGCS+烟草的抗氧化物质活性APX、POD和CAT均显著高于野生型与转LpGCS-烟草(图11C、D、E)，表明转LpGCS+烟草的抗氧化能力增强。综上所述，LpGCS基因在烟草中的过量表达可以提高植株的耐镉胁迫能力，为进一步利用该基因转化多年生黑麦草培育抗重金属植株奠定基础。

图11　镉胁迫下转正、反义LpGCS烟草与野生型植株

3结论与讨论

本研究获得全长为1674 bp的基因LpGCS(GenBank登录号：KJ551844)，并对其所编码蛋白质结构和功能进行了分析和预测。所获得的LpGCS序列以及该序列所编码蛋白质的性质、二级结构分析都表明，该基因属于谷氨酸半胱氨酸连接酶家族2，其催化谷胱甘肽从头生物合成的第一步反应，是谷胱甘肽合成的限速酶。LpGCS所编码蛋白与小麦、烟草、水稻、印度芥菜中同源蛋白的同源性都达到了81%以上。通过该基因在烟草中过量表达以及镉胁迫生理试验验证了该基因抗重金属胁迫的功能，从而为通过基因工程方法提高多年生黑麦草对重金属胁迫等非生物胁迫的抗性奠定了良好的基础。

谷胱甘肽在植物应对外界的非生物胁迫中有着非常重要的作用。重金属超富集植物Thlaspigoesigense在自然条件下产生过量谷胱甘肽，被认为是其能够耐受由Cd2+和Ni2+所引起的氧化胁迫的一个重要特征。镉超富集植物东南景天(Sedumalfredii)在被污染立地条件下的适应性也是由于谷胱甘肽的过量生产，而不是植物螯合肽[17]。此外，谷胱甘肽生物合成的增加在遏兰菜(Thlaspicaerulescens)对重金属镉的积累[18]和菥属(Thlaspi)超富集植物对镍的积累有着非常重要的作用[19]，而在转基因杨树中过量表达来源于细菌的γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶基因，则提高了其谷胱甘肽的含量和对重金属锌的吸收能力[20]。谷胱甘肽二镉复合物是酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和一些并不产生植物螯合肽的外生菌根真菌有效的Cd2+转运载体，其细胞内的Cd2+的解毒依赖于此将金属排至液泡中[21]。在烟草[10]、水稻[13]、印度芥菜[22]中过量表达编码γ-ECS或GS蛋白基因，能够提高它们对非生物胁迫的抗性，且在印度芥菜中的过量表达还增加了其对谷胱甘肽、植物螯合肽、重金属镉的积累[23]。

然而，也有研究结果表明，提高谷胱甘肽的含量并不总会增加其对重金属的抗性[24]，这可能是因为谷胱甘肽独自并不能支撑起由重金属胁迫引起的复杂抗性机制[5]。植物螯合肽的过量产生会使得拟南芥中的谷胱甘肽耗尽，这于转基因植株对Cd2+的抗性和积累能力具有负面影响[25]。在拟南芥中过量表达编码酵母谷胱甘肽还原酶基因GSH1和大蒜(Alliumsativum)AsPCS1，单基因和双基因转基因植株对亚砷酸盐和砷酸盐的抗性及积累能力都得到了提高[26]；与转AsPCS1单基因拟南芥相比，转AsPCS1/GS双基因的拟南芥对重金属具有更高的抗性和积累量。这表明，植物螯合肽的合成能力和保持细胞溶质状态稳定与氧化还原动态平衡的能力赋予了植物对金属的抗性和积累特性。

有研究表明，谷胱甘肽还参与调控植物细胞中的H2O2水平[27]，减轻了逆境对植物所造成的伤害。这与本研究的结果相似，胁迫处理后的转LpGCS+烟草不仅光合色素含量增加，而且抗氧化物质活性(SOD、POD和CAT)均显著高于野生型与转LpGCS-烟草，这表明LpGCS基因在烟草中的过量表达提高了烟草的抗氧化能力和光合色素的合成水平，从而增强植株的耐镉胁迫能力。

此外，本研究发现转LpGCS+烟草的株高明显高于转LpGCS-烟草和对照，这表明LpGCS+的过量表达促进了转基因烟草的生长。有研究表明，谷胱甘肽是谷氧还蛋白发挥作用的重要辅助因子，而谷氧还蛋白能够调控花的发育[28]，而本研究也发现转LpGCS+烟草植株有早开花表型。也有研究报道虽然外施谷胱甘肽对烟草的生长影响很小[29]，但是γ-ECS基因的过量表达提高了转γ-ECS基因水稻的产量[30]。由此可以推测γ-ECS基因的过量表达不仅影响植物的抗重金属能力，而且能够影响植物的生长发育。本研究为利用基因工程手段培育抗重金属胁迫的多年生黑麦草新品种提供了重要的理论基础。

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Molecular cloning and characterization in tobacco ofLpGCSfrom perennial ryegrass

WEI Shu-Qiang, SUN Zhen-Yuan*, DAI Xiao-Mei, QIAN Yong-Qiang

ResearchInstituteofForestry,ChineseAcademyofForestry,KeyLaboratoryofTreeBreedingandCultivation,StateForestryAdministration,Beijing100091,China

Abstract:Degenerate primers were designed using CDS sequences of homologous genes and the γ-glutamylcysteine synthetase gene LpGCS was cloned from perennial ryegrass (Loliumperenne) using RT-PCR and RACE techniques, with leaves of ‘Top hat Ⅱ’ as the test material. The full-length sequence of LpGCS gene was 1674 bp (GenBank accession number: KJ551844) with a complete open reading frame (ORF) of 1125 bp. Amino acid sequence identity, structure and homologous sequences with amino acids of 8 other homologous genes were studied and predicted. The protein molecular weight was 42.86 kDa (unstable protein) and its main secondary structure being an alpha helix. The protein amino acid sequence had relatively high homology with 8 other homologous amino acid sequences and had higher homology with graminaceous plants, such as wheat (Triticum aestivum), stiff brome (Brachypodium distachyon) and Japanese rice (Oryza sativa Japonica Group). In addition, sense and antisense plant expression vector pCAMBIA-Ubi-LpGCS+ and pCAMBIA-Ubi-LpGCS- were successfully constructed and transgenic tobacco obtained by agrobacterium mediated transformation. The transgenic tobacco with LpGCS+ grew faster and flowered earlier than the transgenic tobacco with LpGCS-. Exposed to Cd(2+) stress (10 days), physiological and biochemical tests of transgenic and wild-type tobacco showed that the MDA content of LpGCS+ transgenetic plants was lower than the wild type, and POD, SOD and CAT activity higher than those of the wild type. In contrast, the MDA content of LpGCS- transgenetic plants was higher than the wild type and POD, SOD and CAT activity lower. In summary, overexpression of the LpGCS gene in tobacco plants could improve resistance to Cd(2+) stress and lay the foundation for the genetic transformation of perennial ryegrass cultivars able to tolerate heavy metals.

Key words:perenial ryegrass; γ-glutamylcysteine synthetase; gene clone; characterization

*通信作者

Corresponding author. E-mail：sunzy@caf.ac.cn

作者简介：魏树强(1983-)，男，山东临沂人，在读博士。E-mail：weishuqiang2008@163.com

基金项目：国家863项目(2011AA10020902)资助。

*收稿日期：2015-06-05；改回日期：2015-07-06

DOI：10.11686/cyxb2015288

http://cyxb.lzu.edu.cn

魏树强，孙振元，代小梅，钱永强. 多年生黑麦草LpGCS基因克隆及其在烟草中的初步功能验证.草业学报, 2016, 25(4): 121-132.

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