染料木素磺酸钠对去卵巢大鼠骨代谢相关指标的影响*

朱文清，陈金财，姬广林，黄志华

(赣南医学院a．第一附属医院骨科; b．机能实验室，江西　赣州　341000)



染料木素磺酸钠对去卵巢大鼠骨代谢相关指标的影响*

朱文清a，陈金财a，姬广林a，黄志华b

(赣南医学院a．第一附属医院骨科; b．机能实验室，江西赣州341000)

摘要:目的:研究染料木素磺酸钠对去卵巢模型大鼠骨代谢的影响。方法:用去卵巢方法建立大鼠骨代谢紊乱动物模型，选择48只雌鼠，随机分为6组:正常对照组、骨质疏松模型组、阳性药物组、低剂量GSS组(0．1 mg· kg(－1))、中剂量GSS组(0．3 mg·kg(－1))、高剂量GSS组(1．0 mg·kg(－1))。建模1周后，分别给予生理盐水、雌激素和不同剂量的染料木素磺酸钠，给药6周后，检测大鼠骨长度和骨重量指数，同时检测血清电解质、碱性磷酸酶(AKP)、骨钙素(BGP)和肝组织抗酒石酸酸性磷酸酶(TrACP-5b)等生化指标。结果:与模型组相比(1) GSS可以增高腰椎、股骨及胫腓骨重量指数，同时增大股骨和胫骨长度指数(P＜0．001) ; (2) GSS可降低血清中骨钙素的含量，提高降钙素的含量(P＜0．001) ; (3) GSS能升高血清AKP，降低TrACP-5b的含量(P＜0．01)。结论: GSS可通过调节骨形成和骨吸收途径，从而改善去卵巢大鼠骨代谢的紊乱，对绝经后骨质疏松症可能起治疗作用。

关键词:染料木素磺酸钠;去卵巢大鼠;骨代谢

染料木素磺酸钠(Genistein Sulfonate Sodium，GSS)是染料木素磺化后合成的衍生物，相对于其母体不仅保留弱雌激素样作用等药理作用，同时由于GSS水溶性好，更易于人体吸收。前期研究发现GSS可以提高去卵巢大鼠的LEE’S指数并改善脂代谢情况［1］，本研究拟通过建立去卵巢大鼠的骨质疏松模型，观察骨代谢的相关指标，进一步明确GSS对去卵巢大鼠骨代谢影响。

1　材料与方法

1．1实验动物3月龄SPF级SD大鼠，雌性，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供(动物合格证号: HNASLK20120825)，每日均给予普通全价饲料(购自赣南医学动物实验室)喂养，自由饮水。

1．2试剂、药物、材料GSS购自上海天习化工有限公司，分子量为372，用生理盐水溶解配制成所需浓度;戊酸雌二醇由拜耳公司生产，生产批号030A;血清骨钙素(bone gla protein，BGP)和降钙素(calcitonin，CT)试剂盒(北京普尔伟业生物科技有限公司) ;血清碱性磷酸酶(alkaline aphosphatase，AKP)和抗酒石酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase，TrACP-5b)测试盒(南京建成生物工程研究所)。

1．3主要实验仪器MIKRO22R台式冷冻离心机(德国Hittch公司) ; Model 680全自动酶标仪(美国Bio-Rad公司) ; SN-695型智能放免γ测量仪(上海核辐光电仪器有限公司)。

1．4方法

1．4．1实验分组及动物模型制备选择体质量为160～200 g的健康SD雌鼠48只，随机分为6组，每组8只: (A)正常对照组，(B)骨质疏松模型组，(C)阳性药物组，(D) 0．1 mg·kg－1GSS组，(E) 0．3 mg ·kg－1GSS组，(F) 1．0 mg·kg－1GSS组。大鼠用10%的水合氯醛麻醉大鼠后，于平卧位消毒，打开腹腔，行双侧卵巢切除;正常对照组仅探查卵巢，不切除，余操作同模型组。术后1周各组行阴道脱落细胞检查，以明确卵巢切除成功。阳性药物组按80 mg·kg－1戊酸雌二醇混悬液灌胃，GSS治疗组分别按0．1 mg·kg－1、0．3 mg·kg－1和1．0 mg·kg－1剂量灌胃，给药体积为0．5 mL·100 g－1体重，对照组及骨质疏松模型组大鼠给予等体积的生理盐水，每天1次，连续6周。

1．4．2血清血生化检测电解质和AKP、TrACP-5b的活性给药6周后，麻醉大鼠，腹腔动脉取血，2 000 rpm·min－1，4℃，离心15 min，分离血清，于－80℃冰箱保存。电解质仪检测血清钙、镁和磷的水平;酶分析方法检测血清AKP和TrACP-5b活性。

1．4．3放射免疫学方法检测血清BGP和CT指标

取血清，解冻后，3 000 rpm·min－1，离心10 min，取上清100 μL于已编写号码的放免专用试管中，加入相应的抗血清100 μL，混匀，再分别加入125I标记的BGP、CT，混匀，另设总放射值管、非特异反应管(不加入抗血清)及标准管(S0～S5)，4℃孵育24 h。除总放射管值外，每管加入免疫分离剂500 μL，充分混匀，室温放置20 min后，4℃，3 000 rpm· min－1，离心10 min，弃上清，在SN-695型智能放免γ测量仪上测定cpm值，半对数绘制标准曲线，分别计算每管血清BGP、CT的含量。

1．4．4骨重量及长度指数检测分别称量腰椎、股骨和胫腓骨重量，测量股骨和胫腓骨长度，计算腰椎、股骨和胫腓骨重量指数(骨质重量/大鼠重量)，股骨和胫腓骨长度指数(骨质重量/骨质长度)。

1．5统计学分析应用prism 5．0统计学软件进行统计学分析。各测量指标的数据资料以±s表示，组间各测定指标的总体比较采用单因素方差分析，组内各指标的多重比较采用SNK检验，P＜0．05为差异有统计学意义。

2　结果

2．1 GSS对血清Ca2 +、Mg2 +、P含量的影响结果显示，与对照组相比，模型组大鼠血清Ca2 +和Mg2 +含量降低、P含量升高(P＜0．05) ;与模型组相比，阳性药物组血钙水平升高，血磷下降(P＜0．05)，GSS各组血Ca2 +含量升高(P＜0．05)，血P含量与模型组无明显差异(表1)。

表1 GSS去卵巢大鼠血清电解质含量的影响Table 1 GSS serum electrolytes to influence the content of ovariectomized rats

2．2 GSS对血清AKP活性和肝组织STrACP活性的影响AKP结果表明，与对照组相比，模型组大鼠血清AKP活性降低(P＜0．05)，肝组织STrACP-5b活性升高(P＜0．01) ;与模型组相比，阳性药物组肝组织STrACP-5b活性降低(P＜0．01)，GSS治疗组AKP活性升高(P＜0．05)，肝组织STrACP-5b活性降低(P＜0．01) (表2)。

表2 GSS对血清AKP及肝脏STrACP-5b活性的影响Table 2 GSS on serum AKP and liver STrACP-5b activity

2．3 GSS对血清BGP和CT含量的影响结果显示，与对照组相比，模型组大鼠血清BGP水平升高(P＜0．001)、CT含量降低(P＜0．05) ;与模型对照组相比，阳性药物组血清BGP水平降低(P＜ 0．001)、CT含量升高(P＜0．05)，GSS各治疗组BGP含量降低(P＜0．05，P＜0．01，P＜0．001)、CT含量升高(P＜0．05) (表3)。

表3 GSS对血清骨钙素(BGP)、降钙素(CT)的影响Table 3 GSS influence on serum osteocalcin (BGP) and calcitonin (CT)

2．4 GSS对骨密度、骨长度和骨重量指数的影响

结果显示，与对照组相比，模型组大鼠的股骨和胫骨长度指数(P＜0．05，P＜0．001)和腰椎、股骨及胫腓骨重量指数均减小; GSS治疗6周后，股骨、胫骨长度指数和腰椎、股骨、胫腓骨重量指数均提高(P＜0．05，P＜0．01) (表4)。

表4 GSS对去卵巢大鼠骨长度和骨重量指数的影响

3　讨论

目前包括兔子、狗、猴等许多物种用于制作动物骨质疏松模型，其中实验鼠因操作简单，成本低，实验要求差异性最少所以成为最常用的模型动物。实验鼠模型制作方法很多，有卵巢、睾丸、垂体切除，也有使用激素类药物，且最终都能达到骨丢失的目的，但是最终仍然是通过生化检查、骨形态计量学等方法监测和评价该动物模型在预防或治疗骨质疏松症的效果［2］。

正常情况下，骨形成和骨吸收通过各种调节信号紧密相连。当骨吸收越活跃并引起骨密度降低和骨组织微结构破坏时，就会导致骨质疏松症的发生，随之而来就是骨脆性增加和骨折风险增加。骨质疏松症并发症脆性骨折可使病人致残，严重危及病人生活质量［3］。尽管骨质疏松症已经是严重威胁老年人健康的疾病，但是如何诊断和评估骨质疏松症危害性却一直没有定论。国内外比较常用是通过双能X线进行骨密度检测，因为其直接有效的检测和诊断方法，所以在临床上已广泛的使用［4］，但是最近研究认为它仅仅能检测受测部位的骨代谢，不能做全身骨质情况评估，更不能很好的预测患者骨折的风险，因此评估骨质疏松的风险往往需要综合个体情况及生化指标来完成［5］。骨转换指标(bone turnover markers，BTMs)虽然不是诊断骨质疏松的标准，临床效用有限，但是抗骨质疏松治疗后，可以通过骨转换指标全面评价人体骨的代谢情况，从而间接判断抗骨质疏松效果并预测骨折的风险，因此得到不少学者高度重视［6］。

成骨细胞(Osteoblast，OB)和破骨细胞(Osteoclast，OC)是骨代谢最重要的核心细胞，骨代谢的关键就是这两种细胞代谢变化的结果［7－8］。目前反应成骨细胞标志物较多，其中包括AKP，BGP，I型前胶原羧基末端肽(PICP)等。其中AKP和BGP因拥有较好的生物稳定性、较低的个体差异性而且检测方法简单已经成为评估成骨细胞活性的重要手段［9］，PICP同样作为成骨代谢产物也是反应成骨细胞活性的重要指标，但是其结果易受干扰，如半衰期只有6～8分钟［10］，且体内受不同时间变化而变化，研究发现PICP凌晨比中午人体含量高20%，Vasikaran S等人研究认为PICP来源可能不仅仅于骨代谢，因此没有很好的特异性，因此一定程度上限制其实践运用［11］。TrACP是目前临床上判断成骨细胞和破骨细胞活性的重要的生化标志物，也是骨质疏松症重要监测指标之一。体外实验证明，在骨吸收过程中，破骨细胞活跃，同时大量分泌TrACP，因此TrACP水平可反映破骨细胞活性和骨吸收状态。绝经期后的女性因为内源性雌激素减少，骨重建失衡，骨吸收大于骨形成，会出现TrACP显著增加。在正常人血清中，TrACP以两种基化形式存在: TrACP-5a和TrACP-5b。其中TrACP-5b则主要由破骨细胞分泌。故测定血清中的TrACP-5b活性，可以反映体内OC活性和骨吸收状态。目前研究认为TrACP-5b的活性直接反应了OC在骨组织中的数量，是反映OC活性的特异性指标，目前已经成为第二代骨吸收生化标志［12－13］。试验中GSS组尤其是中剂量组可以提高AKP活性，降低肝组织STrACP-5b活性，侧面反映其可以提高成骨细胞活性，抑制破骨细胞活性，达到改善骨代谢作用。

通过实验我们发现，GSS能提高成骨细胞数量和功能，同时产生类雌激素对破骨细胞的抑制作用，而且综合各项指标，中剂量组更为明显，符合不少学者认为类雌激素药物效果并非量大为好的观点。综上，GSS通过对成骨细胞和破骨细胞的作用，在整体上对绝经后的高转换型骨质疏松症进行改善，降低骨折风险，为进一步临床运用提供理论基础。

参考文献:

［1］朱文清，李增明，李红燕，等．染料木素磺酸钠对去卵巢大鼠甘油三酯和胆固醇代谢的调节作用［J］．赣南医学院学报，2013，33(2) : 167－169．

［2］Lelovas PP，Xanthos TT，Thoma SE，et al．The Laboratory Rat as an Animal Model for Osteoporosis Research［J］．Comp Med，2008，58: 424－430．

［3］张智海，刘忠厚，李娜．中国人骨质疏松症诊断标准专家共识［J］．中国骨质疏松杂志，2014，20(9) :1007－1010．

［4］Lorentzon M，Cummings SR．Osteoporosis: the evolution of a diagnosis［J］．J Intern Med，2015，277(6) :650－661．

［5］Edwards MH，Dennison EM，Aihie Sayer A，et al．Osteoporosis and Sarcopenia in Older Age［J］．Bone，2015，80: 126－130．

［6］张萌萌．中国老年学学会骨质疏松委员会骨代谢生化指标临床应用专家共识［J］．中国骨质疏松杂志，2014，20(11) : 1263－1272．

［7］Albert JS，Bhattacharyya N，Wolfe LA，et al．Impaired osteoblast and osteoclast function characterize the osteoporosis of Snyder-Robinson syndrome［J］．Orphanet J Rare Dis，2015，10(1) : 27．

［8］Tang P，Xiong Q，Zhang L，et al．The role of microRNAs in osteoclasts and osteoporosis［J］．RNA Biol，2014，11 (11) : 1355－1363．

［9］Brown JP，Albert C，Nassar BA，et al．Bone turnover markers in the management of osteoporosis［J］．Clin Biochem，2009，42: 929－942．

［10］Seibel MJ．Biochemical markers of bone turnover: part 1: biochemistry and variability［J］．Clin Biochem Rev，2005，26: 97－122．

［11］Vasikaran S，Eastell R，Bruyère O，et al．Markers of bone turnover for the IOF-IFCC Bone Marker Standards Working Group．Markers of bone turnover for the prediction of fracture risk and monitoring of osteoporosis treatment: a need for international reference standards ［J］．Osteoporos Int，2011，22: 391－420．

［12］Gillian Wheater，Mohsen Elshahaly，Stephen P Tuck．The clinical utility of bone marker measurements in osteoporosis［J］．J Transl Med，2013，11: 201．

［13］方玲娜，钟绍，戴如春．染料木素对去卵巢大鼠骨代谢标志物和松质骨微结构的作用［J］．中国慢性病预防与控制，2010，12(18) : 615－616．

Effects of Genistein Sulfonate Sodium on Related Indexes of Bone Metabolism in Ovariectomized Rats

ZHU Wen-qing1，CHEN Jin-cai1，JI Guang-lin1，HUANG Zhi-hua2
(1．Dept．of Orthopedics，the First Affiliated Hospital of Gannan Medical University; 2．Research Center of Gannan Medical University，Ganzhou，Jiangxi 341000)

Abstract:Objective: To observe the effect of Genistein Sulfonate Sodium(GSS) on bone metabolism in ovariectomized rat．Methods: 48 female SD rats were randomly divided into 6 groups: control group，ovariectomized model group，positive drug group，and difference dose of GSS groups (0．1，0．3，1．0 mg·kg(－1))．After one week following ovariectomy，the rats were administrated saline，estradiol valerate or GSS by ig once a day．Six weeks later，the rats were sacrificed，their serum was taken to detect electrolytes，bone gla protein (BGP)，calcitonin (CT) and alkaline aphosphatase (AKP)，and their liver tissues were make to observe tartrate-resistant acid phosphatase (TrACP-5b)．Then the rats were detected bone length and mass index．Results: Compared with the model group，(1) GSS can increase lumbar spine，femur，tibia and fibula weight index，and increase the length index of the femur and tibia(P＜0．001) ; (2) GSS can reduce serum BGP，and improve the content of calcitonin(P＜0．001) ; (3) GSS can elevate serum AKP level and reduce liver TrACP-5b content(P＜0．01)．Conclusion: GSS can improve bone metabolism in ovariectomized rats by regulating bone formation and resorption way，and provide a potential therapeutic approach for postmenopausal osteoporosis．

Key words:Genistein Sulfonate Sodium; ovariectomized rats; bone metabolism

(收稿日期:2015－08－24) (责任编辑:敖慧斌)

通讯作者:黄志华，女，教授，硕士研究生导师，主要从事心脑血管疾病研究。E-mail: gnyxyhzh@163．com

*基金项目:国家自然科学基金(NO．31360250) ;江西省卫计委(NO．20155465) ;赣州市科技局(NO．GZ2014ZSF025)

DOI:10．3969/j．issn．1001－5779．2016．01．003

中图分类号:R285．5

文献标志码:A

文章编号:1001－5779(2016) 01－0013－04