六月雪水提取物体外清除羟自由基活性的实验研究*

李洪亮，周　漫，丁冶春，范小娜

(赣南医学院1．药学院; 2．科研处，江西　赣州　341000)



六月雪水提取物体外清除羟自由基活性的实验研究*

李洪亮1，周漫1，丁冶春1，范小娜2

(赣南医学院1．药学院; 2．科研处，江西赣州341000)

摘要:目的:探讨六月雪水提取物体外清除羟自由基活性，证明六月雪水提取物胃黏膜损伤的保护作用是否与清除自由基有关。方法:基于抗坏血酸还原Cu(2 +)为Cu+，Cu+还原H2O2形成羟自由基·OH，·OH氧化邻菲罗啉，使其处于激发态，退激发时发光。抗氧化剂可以清除·OH，可以减少激发态邻菲罗啉的产生，使发光强度降低，运用此技术检测六月雪水提取物体外清除羟自由基的能力。结果:在六月雪水提取物的原浓度(3 000．000 mg·mL(－1))时，羟自由基被清除了98．978%，随着六月雪水提取物溶液的稀释，其清除羟自由基的能力逐渐降低，当稀释为原浓度的1/16 384浓度(0．183 mg·mL(－1))时，六月雪水提取物溶液清除羟自由基的能力与空白组比较接近。结论:六月雪水提取物具有良好的体外清除羟自由基活性的能力，随着六月雪水提取物溶液的稀释，其清除羟自由基的能力逐渐降低。

关键词:六月雪水提取物;羟自由基;邻苯三酚

六月雪Serissa Serissoides(DC．) Druce(SSD)来源于茜草科植物小灌木白马骨的全草或根，主要含有挥发油类、甾体类、萜类以及糖类等化学成分;其性凉、味苦、微辛，归肺、脾、肝、胃经［1］。具有疏风利湿、清热解毒的功效，临床上主要用于时行感冒，咳嗽咽痛，牙龈肿痛，目赤肿痛，湿热黄疸，暑湿泻痢，淋浊带下，风湿关节痛，历节风痛，跌打损伤以及痈疽肿毒，瘰疬恶疮等症［2］。本课题组主要针对胃黏膜损伤的保护作用通过无水乙醇法、阿司匹林法、水浸应激法及利血平法实验小鼠胃黏膜损伤动物模型，测定给药后胃黏膜损伤面积，结果证明六月雪对胃黏膜损伤具有保护作用［3］。在对无水乙醇胃饲诱发急性胃黏膜损伤的动物模型考察研究中发现，六月雪提取物对实验性胃黏膜损伤具有显著的修复作用［4］。为了进一步研究探讨六月雪对实验性胃黏膜损伤保护作用机制，本文重点观察六月雪水提取物体外清除羟自由基活性的研究，以判断六月雪对胃黏膜损伤的保护作用是否与清除自由基有关。

1　仪器与试剂

BPCL-1-G-C微弱发光测量仪(中国科学院北京生物物理研究所) ;邻苯三酚，江西洪都化学制剂厂; 3-氨基邻苯二甲酰肼(luminol)，Sigma公司;乙二胺四乙酸二钠(EDTA)，上海化学试剂总厂;其他试剂均为分析纯。

2　清除羟自由基(·OH)实验

2．1试液配制本实验采用邻菲罗啉-Cu2 +-抗坏血酸-H2O2体系。

CuSO4溶液: 124．8 mg CuSO4·5H2O溶于双蒸水至500 mL。

PBS(pH 6．2)溶液: 0．2 mol·L－1NaH2PO4溶液81．5 mL和0．2 mol·L－1Na2HPO4溶液18．5 mL混合后加双蒸水稀释至400 mL。

邻菲罗啉溶液: 19．6 mg邻菲罗啉溶于PBS(pH 6．2)溶液至100 mL。

Vc溶液: 17．6 mg Vc溶于PBS(pH 6．2)溶液至100 mL。

0．15%H2O2溶液: 30% H2O2溶液加入双蒸水稀释至0．15%。

BBS(pH 9．0)溶液: 0．05 mol·L－1Na2B4O7· 10H2O溶液80 mL和0．2 mol·L－1H3BO3溶液20 mL混合。

2．2·OH的产生与清除本反应的原理以Fenton反应为基础［5］，抗坏血酸还原Cu2 +为Cu+，Cu+还原H2O2形成羟自由基·OH，·OH氧化邻菲罗啉，使其处于激发态，退激发时发光。抗氧化剂可以清除·OH，·OH对多元酚类成分主要是脱氢反应而被还原，因此可以减少激发态邻菲罗啉的产生，所以发光强度降低。操作步骤为，在发光杯中加入50 μL样品溶液(以相同量的蒸馏水作空白对照)、50 μL CuSO4溶液、20 μL Vc溶液、50 μL邻菲罗啉溶液和50 μL 0．15% H2O2溶液，再加入BBS溶液780 μL启动反应，记录发光强度(Chemical Luminescence，CL)。CL值以峰高计算，根据CL大小可以判断物质清除·OH的能力。自由基清除率用以下公式计算。

自由基清除率= (CL空白对照－CL样品) / CL空白对照×100%

邻菲罗啉-Cu2 +-抗坏血酸-H2O2体系的动力曲线见图1。从该动力曲线图可见，该反应在启动后，将在200秒钟左右出现最高峰，但其淬灭速度比较慢，要到1 000秒之后发光才基本结束。

图1　邻菲罗啉-Cu2 +-抗坏血酸-H2O2体系动态曲线

②Fenton反应，过氧化氢在Cu+作用下被还原成羟自由基(·OH)

③羟自由基(·OH)夺取还原剂的一个氢而被还原。

④剩余的·OH将邻啡罗啉氧化为电子激发态，退激发时释放一个光子。

以高浓度逐渐稀释的方式检测不同浓度样品对CL的影响，每个浓度样品都做相应的空白对照。根据以上公式计算对羟自由基(·OH)的清除率，建立量效关系曲线，通过量效曲线求算出发光抑制率为50%时样品的浓度(IC50)值，IC50值反映了样品对羟自由基(·OH)的清除能力。IC50值越小，表明样品清除羟自由基(·OH)的能力越强。

该体系的工作原理如下:

①Cu2 +被抗坏血酸还原为Cu+。

3　结果

根据表1的结果计算，六月雪水提取物对于羟自由基的IC50= 1．169 mg·mL－1。由抑制曲线图(图2)可以看到，在原浓度(3 000．000 mg·mL－1)时，羟自由基基本被完全清除，稀释为原浓度的1/4、1/16、1/64时，羟自由基同样被完全清除(清除率都在99%左右)，稀释为原浓度的1/256(11．719 mg· mL－1)时，用超微弱发光仪可检测到少量光子，在随稀释浓度的逐渐降低，其清除羟自由基的能力逐渐降低，当稀释为原浓度的1/16 384 (0．183 mg· mL－1)时，六月雪水提取物对羟自由基的清除率仍保持在12．727%，说明六月雪水提取物对羟自由基有极强的清除能力。各曲线达峰时间随浓度的逐渐稀释而逐渐提前，说明六月雪水提取物在该体系中不仅可以清除羟自由基，而且可以延缓羟自由基的产生。在此反应体系中，原浓度的抑制率反而低于初始的几个稀释浓度，其具体原因有待进一步研究。

表1六月雪水提取物对羟自由基的抑制率

图2　六月雪水提取物对羟自由基的抑制曲线

4　讨论

过氧化氢(H2O2)是一种活性氧，很容易透过细胞膜进入细胞，并且通过过渡金属离子参与的Fenton反应产生羟自由基(·OH)，引起机体的氧化损伤，即所谓氧化应激反应［6］。自由基具有高度的化学活性，是机体有效的防御系统，若不能维持一定水平则会影响机体的生命活动［7］。有研究表明，氧化应激和过氧化氢的剂量有关，低剂量的过氧化氢会使机体产生适应性。基础研究活性氧自由基在体内主要有三种形式: H2O2、·OH、O2－，羟自由基它是人体新陈代谢的副产物，可以与生物体内的许多物质如脂肪酸、蛋白质、核酸等作用，造成相关细胞结构和功能的破坏，在化学致癌过程中起着不可忽视的作用［8］。羟自由基·OH是体内最活泼的自由基，攻击能力最强，对机体危害最大，可导致许多病理变化，如引发不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应，并损伤膜结构及功能，因此羟自由基的检测对于自由基的生物作用研究具有重要意义［9］。众多研究已证明，氧化损伤与衰老、肿瘤、糖尿病、动脉硬化以及人类免疫缺陷病毒(HIV)感染等均有密切关系［10］。因此，如何清除自由基，防止氧化对生物体细胞和组织的破坏得到了普遍关注。寻找高效、低毒的抗氧化剂一直是近年来研究者们关注的课题。

六月雪在江西赣南18个县均有分布、资源十分丰富，六月雪水提取物在赣南民间常用作酒精性胃出血，并且效果十分显著，前期研究发现六月雪水提取物单独用药对乙醇诱导的胃黏膜损伤有明显的修复作用，能明显降低溃疡面积指数，六月雪与黄花倒水莲联合用药对无水乙醇、阿司匹林、盐酸致大鼠胃黏膜损伤有明显的保护作用，并且有一定的抗炎、促血小板生成、促凝血作用，作用机制可能和凝血因子以及调节激素水平有关［4，11］。羟自由基是应激性胃溃疡的重要致病因子，最近研究发现六月雪水提取物作为羟自由基清除剂预先处理大鼠，均可显著地减轻胃粘膜损伤，应激时，胃粘膜内的脂质过氧化分解产物丙二醛的含量显著升高，组织化学的研究显示，胃粘膜层含有丰富的黄嘌呤氧化酶，其活性在应激时明显升高，预先用六月雪水提取物处理大鼠以抑制黄嘌呤氧化酶的活性，可使胃粘膜损伤显著减轻。本实验我们再次验证六月雪水提取物在原浓度(3 000．000 mg·mL－1)时，羟自由基基本被完全清除，稀释为原浓度的1/4、1/16、1/64时，羟自由基同样被完全清除(清除率都在99%左右)，稀释为原浓度的1/256(11．719 mg·mL－1)时，用超微弱发光仪可检测到少量光子，在随稀释浓度的逐渐降低，其清除羟自由基的能力逐渐降低，当稀释为原浓度的1/16 384(0．183 mg·mL－1)时，六月雪水提取物对羟自由基的清除率仍保持在12．727%，说明六月雪水提取物对羟自由基有极强的清除能力。说明六月雪水提取物在该体系中不仅可以清除羟自由基，而且可以延缓羟自由基的产生。六月雪水提取物中清除自由基活性成分的分离以及清除羟自由基的具体作用机制，是我们下一步准备研究的内容。

参考文献:

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［4］李洪亮，程齐来，范小娜．六月雪水提取物对实验性胃黏膜损伤的修复作用［J］．时珍国医国药，2009，20 (2) : 333－334．

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［6］陈美珍，余杰，郭慧敏．大豆分离蛋白酶解物清除羟自由基作用的研究［J］．食品科学，2002，23(1) : 43－46．

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［11］丁冶春，李洪亮，孙立波，等．二味中药复方对实验性胃黏膜损伤诱导的血液指标的影响［J］．时珍国医国药，2012，23(10) : 2461－2463．

Experimental Study of Serissa Serissoides Water Extraction in Vitro on Hydroxyl Radical Scavenging Activity

LI Hong-liang1，ZHOU Man1，DING Ye-chun1，FANG Xiao-na2
(1．School of Pharmacy; 2．Scientific Research Department，Gannan Medical University，Ganzhou，Jiangxi 341000)

Abstract:Objective: To study the function of water extraction in Serissa serissoides in vitro to scavenge the activities of hydroxyl free radical，and too prove thatthe protective effect of Serissa serissoides water extract on gastric mucosa injury is related to scavenging free radicals．Methods: Cu(2 +)was reduced to Cu+by ascorbic acid，which was in the excited state，and the luminescence of the excitation state．Antioxidants which can scavenge·OH，can decrease the excited state orth ophenanthroline and the emission intensity was employed to detect the scavenging ability of Serissa serissoides water extraction to hydroxyl radical in vitro．Results: With Serissa serissoides water extract of original concentration (3 000．00 mg· mL(－1))，hydroxyl radical was cleared of 98．978%．With the dilution of Serissa serissoides water extract solution，its ability to scavenge hydroxyl free radical decreased gradually．When the concentration of the dilution was the 1/16 384 of the origional concentration (0．183 mg·mL(－1))，the ability of Serissa serissoides water extract solution to scavenge hydroxyl free radical is close to that of the blank group．Conclusion: Serissa serissoides water extract has a good ability to savange the activity of hydroxyl free radical in vitro．As the dilution of the water extract solution in Serissa serissoides，its ability to scavange hydroxyl free radicals is gradually reduced．

Key words:Serissa serissoides water extracts; hydroxyl radical; benzene three phenol

(收稿日期:2015－10－15) (责任编辑:敖慧斌)

通讯作者:范小娜，女，教授，硕士生导师，主要从事中草药活性成分筛选及新药研发工作。E-mail: fxn918@126．com

*基金项目:江西省自然科学基金(编号: 20132BAB205078) ;江西省教育厅科技项目(编号: GJJ13680)

DOI:10．3969/j．issn．1001－5779．2016．01．007

中图分类号:R285．5

文献标志码:A

文章编号:1001－5779(2016) 01－0027－04