非小细胞肺癌患者胸水与外周血检测EGFR基因突变的比较

刘根贤，慕进勇，张守翠

(1.山东省日照市妇幼保健院检验科，山东日照 276826;2.山东省荣成市石岛人民医院检验科，

山东荣成 264309;3.山东省日照市中医院骨科，山东日照 276800)

·临床研究·

非小细胞肺癌患者胸水与外周血检测EGFR基因突变的比较

刘根贤1，慕进勇2，张守翠3

(1.山东省日照市妇幼保健院检验科，山东日照 276826;2.山东省荣成市石岛人民医院检验科，

山东荣成 264309;3.山东省日照市中医院骨科，山东日照 276800)

目的 比较外周血和胸水两种样本检测EGFR基因突变的情况，为临床选取合适的送检标本提供参考。方法 选取非小细胞肺癌(NSCLC)合并恶性胸腔积液病例65例,收集血液和胸水标本，分别抽取DNA，使用巢式PCR扩增检测。采用SPSS19.0软件进行数据处理。结果 65例NSCLC患者中有吸烟史的患者占44.6%。病理类型为腺癌的有53例，占81.5%；非腺癌12例，占18.5%。NSCLC分期为Ⅲb者有34例，占52.3%；Ⅳ31例，占47.7%。胸水总检出率(36.9%)高于血清总检出率(18.5%)，两种样本中19号外显子突变检出率均高于21号外显子的。19号外显子的突变类型为删除突变，即DelE746-A750、DelE746-T751，胸水中多出一种DelL747-P753 insS。21号外显子的突变类型为点突变，即L858R和L861Q。结论 虽然外周血中的EGFR基因突变的检出率低于胸水中的，但是19和21外显子的突变情况在外周血和胸水标本中基本一致，循环DNA可以反映组织中DNA的变化。

非小细胞肺癌； 胸水； 外周血； EGFR基因突变

非小细胞肺癌(NSCLC)约占肺癌的80%，恶性程度高，发现时多数已经处于晚期。传统的治疗办法，如化疗、放疗和手术的疗效不尽如人意。随着对肺癌生物标志物的深入研究和致病机理的逐步阐明，分子靶向治疗已经成为肺癌综合治疗中的最新模式，受到广泛关注。目前NSCLC治疗的重要方向之一即以肿瘤细胞分化增殖相关的酶为靶点，其中以表皮生长因子受体(EGFR)为靶点的分子靶向治疗取得了较广泛的临床应用。EGFR基因突变主要发生在18～21外显子，其中19和21外显子突变占据约90%。大量临床研究显示检测EGFR基因突变可以筛查对靶向药敏感的患者，从而实现靶向个体化治疗[1-3]。但是EGFR基因突变样本往往由组织取样获得，创伤大，操作繁琐。近年来，NSCLC患者的外周血循环DNA分析可一定程度反映肿瘤情况，其检测得到了广泛关注[4]。胸水中可直接收集肿瘤脱落细胞，也是EGFR基因突变检测的常见样本来源[5]。本文比较了外周血和胸水两种样本检测EGFR基因突变的情况，为临床选取合适的送检标本提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取NSCLC合并恶性胸腔积液病例65例，其中男35例，女30例，年龄37～79岁，平均年龄62岁。所有血液样本均使用EDTA-K2真空采血管收集。采血后及时离心(3 500 r/min，10 min)分离血浆，取上清，获得无血细胞成分的血浆，用1.5 mL离心管分装。每例抽取胸水250～500 mL。

1.2 DNA抽提及巢式PCR扩增检测

1.2.1 外周血样本使用QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen)试剂盒抽提。胸水脱落细胞经石蜡包埋后，使用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (Qiagen)试剂盒抽提。抽提步骤按照试剂盒说明书进行。

1.2.2 巢式PCR扩增目的片段为EGFR基因19和21号外显子。引物参照文献设计[6]，引物合成及测序由上海生工生物工程公司完成。反应条件为：94 ℃，5 min;94 ℃，40 s、58 ℃，45 s、72 ℃，1 min；35个循环;72 ℃延伸7 min。琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒DR01(北京艾德莱生物科技有限公司)。

1.3 统计学处理 采用SPSS19.0软件进行数据处理，计量资料采用t检验，计数资料采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 入选患者临床资料 选取NSCLC合并恶性胸腔积液病例65例，男35例(阳性率71.4%)，女30例(阳性率28.6%)；年龄37～79岁，平均年龄62岁。有吸烟史的患者占44.6%。病理类型为腺癌的有53例，占81.5%；非腺癌12例，占18.5%。NSCLC分期为Ⅲb期有34例，占52.3%；Ⅳ期31例，占47.7%。

2.2 19和21外显子突变检出情况 65例NSCLC患者同时检测血清样本和胸水样本中的EGFR基因突变情况，胸水总检出率(36.9%)高于血清总检出率(18.5%)，两者相比差异有统计学意义(P<0.05)。两种样本中19号外显子突变检出率均高于21号外显子的。19号外显子的突变类型为删除突变，即DelE746-A750、DelE746-T751，胸水中多出一种，即DelL747-P753 insS。19号外显子的突变类型为点突变，L858R、L861Q。

表1 目的基因及引物序列

表2 血清和胸水标本EGFR突变检出情况比较

3 讨 论

EGFR属于受体酪氨酸激酶，存在于大部分正常上皮和部分间叶细胞，多种肿瘤组织中有过度表达，是肿瘤细胞增殖、浸润转移、血管生成等生物行为的重要调节因素。EGFR在正常肺组织中不表达或低表达，而在非小细胞肺癌中高表达，主要原因为过表达和基因扩增等，其表达与高分期、生存期缩短、淋巴结转移等相关。病理状态下，EGFR通路异常激活，EGFR酪氨酸激酶活性增强，下游信号通路随之激活，细胞生长无法抑制，造成肿瘤细胞增殖、侵袭、转移等生物学特性得以强化。由于EGFR酪氨酸激酶是信号传递的必要条件之一，因而成为NSCLC治疗的重要靶分子，阻断EGFR信号传递通路可以抑制肿瘤生长，使细胞停留在G1期，诱导肿瘤细胞凋亡。EGFR基因突变导致细胞内酪氨酸激酶区改变，使得治疗用药(小分子酪氨酸激酶抑制剂)更容易结合，从而增加药物的敏感性[7]。大量研究表明，酪氨酸激酶编码区的基因突变主要是19外显子的缺失和21外显子的L858R点突变[8-10]。因此，检测EGFR基因的19和21外显子的突变情况可以从NSCLC患者中筛选出合适的治疗对象进行有针对性的治疗，有助于提高药物疗效。

本研究发现，外周血中19号外显子的删除突变是由于第2 236～2 250核苷酸缺失或者第2 236～2 253核苷酸缺失，分别导致746位谷氨酸至750位丙氨酸缺失(DelE746-A750)或者746位谷氨酸至751位苏氨酸缺失(DelE746-T751)。胸水中19号外显子还发现另外一种，即第2 240～2 257核苷酸缺失，导致747位亮氨酸至753位苯丙氨酸缺失，并插入丝氨酸(DelL747-P753 insS)。外周血和胸水中的21号外显子突变情况相同，即第858位密码子出现T/G转换，导致编码产物由亮氨酸变为精氨酸(L858R)和第861位密码子出现T/A转换，导致编码产物由亮氨酸变为谷氨酰胺(L861Q)。

循环DNA来源于细胞凋亡(正常人群，长度185～200 bp)和细胞坏死(肿瘤患者，以长链DNA片段为主)。肺癌在演化的不同阶段会伴随特定基因的改变，这些改变了的DNA片段会进入循环中。因此循环DNA检测对于肿瘤的早期诊断和预防有重要意义。大量研究表明，循环DNA与肿瘤组织DNA的基因变化一致性较好，因此，国内外学者尝试对NSCLC外周血循环DNA分析发现肿瘤特异性标志物。为了寻找易获得的标本进行EGFR基因突变检测，近年来国内外研究者将注意力集中在了胸水和外周血上。恶性胸腔积液是晚期NSCLC患者的常见并发症，采用胸水标本有操作风险小、检出率高、与组织标本高度一致等优点。但是对于NSCLC早期EGFR基因突变检测，仍有待于进一步研究。外周血循环DNA是存在于血浆等体液中的游离DNA，NSCLC患者的肿瘤组织可通过细胞坏死、凋亡等方式释放出，其含量与肿瘤的进展、治疗及预后相关[2-3,11]。本研究对65例NSCLC患者的EGFR基因突变情况作一比较，发现外周血中的EGFR基因突变的检出率低于胸水中的，差异有统计学意义。但是19和21外显子的突变情况在外周血和胸水标本中基本一致，循环DNA可以反映组织中DNA的变化。随着外周血循环DNA检测技术的不断进步，检出率的不断提升，将更加便于临床的开展和实施，这将对肺癌患者的诊断、筛查、治疗和随访有重要的意义，为临床检测提供方便有效的诊断方法，便于临床的开展和实施，具有广阔的应用前景。

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10.3969/j.issn.1673-4130.2016.07.051 文献标识码：A 文章编号：1673-4130(2016)07-0985-03

2015-10-24)