自噬相关蛋白Beclin1、LC3在甲状腺癌合并颈部淋巴结转移中的表达及临床意义

陈小林，华清泉

(武汉大学人民医院耳鼻咽喉－头颈外科，湖北武汉　430060)



自噬相关蛋白Beclin1、LC3在甲状腺癌合并颈部淋巴结转移中的表达及临床意义

陈小林，华清泉

(武汉大学人民医院耳鼻咽喉－头颈外科，湖北武汉430060)

【摘要】目的:探究分析与细胞自噬相关的蛋白Beclin1及LC3在甲状腺癌合并颈部淋巴结转移中的表达及其在临床治疗中的意义。方法:采用免疫组织化学方法检测，选取48例我院2012年2月至2014年2月收集的甲状腺癌组织、30例癌旁正常组织用以检测Beclin1及LC3蛋白表达，另取38例甲状腺癌转移淋巴结以及30例的正常淋巴结临床标本，用以检测Beclin1及LC3蛋白表达。结果:在取材的所有样本中均有表达Beclin1，但在甲状腺癌组织中含量低于癌旁正常的甲状腺组织( P＜0. 01)，转移淋巴结中Beclin1水平明显低于正常淋巴结组( P＜0. 01) ;免疫组化结果显示在所有样本中也检测到LC3蛋白表达，在甲状腺癌组织中的含量最低，并且显著低于癌旁甲状腺组织( P＜0. 01)，在发生转移的淋巴结组织中，LC3含量低于正常淋巴结组织( P＜0. 01)。结论:自噬功能相关蛋白Beclin1与LC3的表达与甲状腺癌是否发生转移密切相关，是肿瘤向囊外扩展的直接标记。该蛋白具有作为甲状腺癌淋巴结转移的术前评估指标的潜在可能，具有一定的指导意义。

【关键词】甲状腺癌;淋巴结转移; Beclin1; LC3

网络出版时间: 2016-3-4 10∶16网络出版地址: http: / /www.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20160304.1016.046.html

甲状腺癌在人类头颈部癌症中最为常见，也是临床最为常见的恶性肿瘤，易发生淋巴结转移类癌症。其发病机制目前尚未完全明确，主要认为与辐射、遗传、饮食等单因素或多因素有关。目前主要的治疗手段以手术治疗并辅助以化疗为主。但由于其易发生淋巴结转移，手术时机及手术操作难易把握，造成预后不佳。细胞自噬是细胞的一种能动过程，这一功能在进化过程中是高度保守的［1－3］。细胞通过自噬泡中的溶酶体等将细胞内变性坏死的细胞器与部分胞浆水解，将分解产生的氨基酸及核苷酸等物质供细胞再利用。机体细胞通过自噬反应而变得更加适应微环境的变化，使细胞生存或者自噬性死亡。细胞自噬过程与肿瘤的发生、发展和转移等密切相关。在肿瘤发生的早期，细胞自噬可发挥抑制肿瘤的作用;当肿瘤细胞继续进行分裂增殖时，细胞自噬的功能也发生转变，可促进肿瘤细胞的生长。

Beclin1通过与ClassⅢPI3K形成复合物后参与自噬体的形成，是调节细胞自噬的关键蛋白质，也是细胞启动自噬的标志［4］。Beclin 1等位基因的缺失性突变常发生于乳腺癌细胞株中，并且在乳腺癌组织中，Beclin1蛋白水平也较周围正常组织低［5］。这表明Beclin1可能具有抑制肿瘤的作用。LC3在哺乳动物Autophagy的形成中参与泛素样蛋白加工修饰过程。LC3在细胞内有两种存在形式: LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ［6］。当细胞内发生细胞自噬时，通过检测细胞内的LC3及其向LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ的转化就可以判断细胞自噬是被诱导还是被抑制。本次研究通过对甲状腺癌及其周围组织中Bclin1及LC3的检测，探讨细胞自噬在甲状腺癌的形成和转移中的作用。

1　材料与方法

1.1一般资料

实验中所有标本来自我院2012年2月至2014 年2月间手术时取材，取材后除在液氮中保存标本外，另外取标本的部分经过4%多聚甲醛的固定，再经常规石蜡包埋并做成厚度为4 μm的病理组织学切片，经两位以上的主治和病理医生进行病理诊断。样本中48例甲状腺癌患者术后标本，男性25例，女性23例，患者年龄31～73岁，平均年龄( 51. 2± 1. 5)岁; 38例伴有颈部淋巴结转移患者，其中男性21例，女性17例，平均年龄( 53. 1±0. 9)岁。

1. 2方法

本实验中所用一抗(兔抗人)均购自美国CST公司，二抗(山羊抗兔)购自碧云天生物技术公司。S-P免疫组化试剂盒及DAB显色试剂盒由北京康为世纪生物科技有限公司提供。

首先，将标本切片在60℃条件下孵化10 min，然后置于二甲苯中脱蜡20 min，用浓度逐步降低的乙醇溶液继续脱蜡去水10 min。室温下用0.3%的H2O2抑制内源性的过氧化物酶活性20 min。用微波法修复以提高抗原的暴露程度，采用1.5%正常山羊血清封闭标本的非特异性结合位点30 min。接着将所有切片用生物素与亲和素分别孵化20 min，然后用一抗孵化1 h，二抗孵化30 min。室温下用Strepta-vidin-HRP处理30 min，此时即可用DAB加H2O2在室温下显色10 min，苏木精染色5 min。阴性对照组为正常的兔血清。

1.3 S-P染色的结果评估

本次实验染色结果由两位病理科医生进行独立评估，评估方式主要为半定量式。Beclin1与LC3的染色强度可从0～4级判断:设置0为阴性结果，依次有( + )为极低阳性结果，( + + )为弱阳性结果，( + + + )为阳性结果，( + + + + )为最强阳性结果。分级的依据为多数肿瘤细胞的染色强度，同时也要考虑具备同样染色强度的肿瘤细胞数的百分比。最后，将得分由染色强度和具有同一染色强度得出的细胞百分百相乘之后为最后得分。评估过程采用单盲法。

1.4统计学分析

本实验结果采用统计学软件SPSS 17. 0进行处理，其中组间对比采用多组等级资料的秩和检验，在组间两两比较可采用两组等级资料的秩和检验，以P＜0. 05表示具有统计学意义。

2　结果

2.1一般资料对比

本实验中患者临床分期判断标准依据美国癌症联合会的甲状腺癌分期标准，患者的年龄、性别、肿瘤分期及肿瘤大小等一般资料见表1。

表1　不同组患者的一般资料对比

2.2 Beclin1与LC3表达情况

染色结果显示，在30例甲状腺癌组织中Beclin1阳性表达为2例( 6. 7%)，LC3蛋白在甲状腺癌组织具有阳性表达为1例( 3. 3%)，两者在癌旁正常组织表达均为阳性; Beclin1在具有甲状腺癌转移的淋巴结的表达为阳性的3例( 10%)，LC3蛋白在具有甲状腺癌转移的淋巴结的表达为阳性的1例( 3. 3%)，在正常淋巴结表达均为阳性，具体见表2。

表2　各组中Beclin1与LC3表达情况( n，%)

3　讨论

细胞自噬是一种高度保守的生物行为，它可以对体内的大分子物质及细胞产生的内源性物质通过溶酶体途径进行降解，又可根据物质转运通道的不同再分为微自噬、巨自噬和分子伴侣介导的自噬［7］。细胞的自噬行为不但能在细胞新陈代谢过程中发挥重要作用，而且当细胞受到来自外界环境的破坏受损时，自噬又是一种自身防御，同时自噬也在肿瘤等多种病理过程中发挥作用。研究［8］发现，细胞自噬可以当作细胞的一种自我保护机制，防止细胞受营养过低、化疗带来的辐射等损伤;另外细胞出现过度自噬行为也可使细胞死亡，这一点可用于抑制肿瘤生长。

Beclin1是自噬基因的一种，位于染色体17q21位置，其编码的蛋白质相对分子质量为60×103。Beclin1可参与组成PI3K复合物，并且进一步促进自噬体形成［9］。Beclin1也是一种肿瘤抑制基因，在多种肿瘤中均可发现Beclin1的等位基因缺失而出现低水平的表达，有研究发现［10］，Beclin1发生突变的小鼠可出现较高的患肿瘤概率，并且自噬能力降低。这说明Beclin1具有阻止肿瘤细胞的转化，抑制肿瘤生长的作用。LC3在细胞未出现自噬时，可转化为具有胞质可溶性的LC3Ⅰ型，属于常规表达。但当细胞内出现自噬时，Ⅰ型的LC3就可经过泛素样的系列加工修饰过程，与自噬细胞膜表明的磷脂酰乙醇胺想结合，转化呈Ⅱ型的LC3。这样LC3-Ⅱ就可结合到自噬体膜上，并且LC3-Ⅱ的量与细胞内自噬泡的数量呈正比［11］。所以由此推论，LC3的表达强度可反应细胞自噬活性。已有研究［12］发现，LC3的高表达与肿瘤的大小以及肿瘤坏死密切相关。本研究发现，在甲状腺癌原发病灶以及转移病灶均出现了LC3的表达降低现象。

基于以上研究，我们的结果符合Beclin1与LC3作为抑癌基因的前期研究，在甲状腺癌组织及转移淋巴结中，我们发现Beclin1与LC3的表达均是降低的，造成的结果就是在表达降低的组织细胞的自噬能力降低，导致细胞生长周期增加，间接造成了细胞增值能力和转移能力的增强，从而为肿瘤的形成提供有利条件。虽然本实验中，我们揭示了Beclin1 与LC3在甲状腺癌组织中表达均是降低的，但二者是否具有协同作用或其他相关性我们暂时还不得而知。在后续的研究中，我们还需要对Beclin1与LC3促进细胞自噬相关功能进行进一步的分析，探讨二者在此功能方面是否具有相关性。

综上所述，细胞自噬作为细胞的另外一种程序化死亡方式，在肿瘤的形成过程中具有双重作用，即在肿瘤形成前发挥抑制作用，但肿瘤形成后又可发挥促进作用。本研究中的Beclin1与LC3的在甲状腺癌组织及甲状腺癌转移形成的转移灶的低表达，与自噬的特征相符。但二者发挥作用的具体机制还有待进一步研究。

参考文献

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［12］杨润祥，刘林，马飞，等.甲状腺癌中CCR7和D2-40的表达及其与淋巴结转移的关系［J］.肿瘤防治研究，2014，41 ( 5) : 418－422.

(学术编辑:李蓓)

Expression of autophagy-related protein Beclin1 and LC3 in thyroid carcinoma with cervical lymph node metastases and its clinical significance

CHEN Xiao-lin，HUA Qing-quan
( Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery，People’s Hospital of Wuhan University，Wuhan 430060，Hubei，China)

【Abstract】Objective: To investigate the autophagy-related protein Beclin1 and LC3 expression in thyroid carcinoma with cervical lymph node metastasis and clinical significance.Methods: By immunohistochemistry assay，from our hospital in February 2012 to February 2014 48 cases of papillary thyroid carcinoma tissues and 30 cases of para－tumor normal tissues were gathered to detect expression of Beclin1 and LC3，as well as another 38 cases of papillary thyroid cancer with lymph node metastasis and 30 cases of clinical samples of normal lymph nodes to detect Beclin1 and expression of LC3.Results: Beclin1 were expressed in all samples，being lower in thyroid cancer than adjacent normal thyroid tissue ( P＜0. 01)，metastatic lymph nodes Beclin1 level was significantly lower than that of the normal lymph node group ( P＜0. 01).The results showed LC3 protein expression was detected in all samples，its expression was the lowest in thyroid papillary tissue，beingsignificantly lower than that of their surrounding thyroid tissue ( P＜0. 01) andin the event of metastasis lymph LC3 content was lower than that of in normal lymph nodes ( P＜0. 01).Conclusion: Autophagy protein Beclin1 and LC3 expression are closely related to thyroid cancer metastasis，and tumor extracapsular extension of direct labeling.The proteins has a potential as a preoperative evaluation of lymph node metastasis of thyroid cancer，which has a certain significance.

【Key words】Thyroid cancer; Lymph node metastasis; Beclin1; LC3

作者简介:陈小林( 1976－)，女，主治医师。通讯作者:华清泉，E-mail: 504226866@ qq.com

收稿日期:2015－07－07

doi:10. 3969/j. issn. 1005-3697. 2016. 01.23

【文章编号】1005-3697( 2016) 01-0084-03

【中图分类号】R736.1

【文献标志码】A