纳米氧化锌对人正常肺细胞BEAS-2B的体外生物学效应

杨彩霞，冯晶，张香梅，马辉

（1.艾森生物（杭州）有限公司，浙江杭州310030；2.中国联合工程公司，浙江杭州310000）

纳米氧化锌对人正常肺细胞BEAS-2B的体外生物学效应

杨彩霞1，冯晶1，张香梅1，马辉2

（1.艾森生物（杭州）有限公司，浙江杭州310030；2.中国联合工程公司，浙江杭州310000）

随着纳米氧化锌的广泛使用，其生物安全性备受关注。以人正常肺上皮细胞BEAS-2B为研究模型，采用WST-1检测技术，研究纳米氧化锌对该细胞的体外生物学毒性；同时，通过检测胞内ROS和胞外LDH释放水平来探讨其作用机制。研究发现，12.5～100 μg/mL浓度范围内，纳米氧化锌对BEAS-2B细胞存在剂量依赖性的毒性作用，并导致BEAS-2B胞内ROS水平和胞外LDH释放显著性增加。这证实了纳米氧化锌的毒性作用与氧化应激效应有密切联系，该研究成果为深入研究和评价纳米氧化锌的生物安全性提供了重要的实验依据。

纳米氧化锌；细胞毒性；氧化应激

随着纳米氧化锌的广泛使用，必然导致部分纳米氧化锌进入到环境中，人体可能通过多种途径接触到，吸入是其中主要的途径[1]。肺是呼吸系统的重要组成部分，担任着气血交换的重要作用，一旦受损，纳米颗粒进入其他组织器官的概率将显著增加[2]。本文探讨纳米氧化锌对人正常肺上皮细胞BEAS-2B的体外生物学效应。

1 材料与方法

1.1 试验材料

人正常肺上皮细胞BEAS-2B（ATCC），纳米氧化锌（平均粒径35nm，Sigma）。

1.2 试验试剂

DMEM：F-12（ATCC），FBS（Gibco），0.25%胰酶（Gibco），PBS（吉诺生物），WST-1（Roche），活性氧自由基（ROS）试剂盒和乳酸脱氢酶试剂盒（碧云天生物技术公司）。

1.3 试验仪器

超净工作台（Thermo），二氧化碳恒温培养箱（Thermo），电热恒温水浴锅（DK-S24，上海精宏），离心机（TD5A-WS，长沙湘仪），流式细胞仪（NovoCyte，ACEA），倒置生物显微镜（TMS，Nikon），DTX 880 Multimode Detector（BECKMAN）。

1.4 细胞接种与染毒处理

处于对数生长期的BEAS-2B细胞，0.25%胰酶消化，细胞悬液为3×104/mL。100μL接种于96孔板，培养24h；纳米氧化锌按照终浓度1.56、3.12、6.25、12.50、25.00、50.00μg/mL和100μg/mL加入96孔板，同时设置未加药对照组。

1.5 WST-1检测

96孔板培养基换成1∶10稀释的WST-1，37℃培养箱孵育3h，测吸光度值，检测波长450nm，参比波长620nm。用GraphPad Prism version 6.01处理数据，IC50通过S形剂量反应的非线性回归模型拟合。

1.6 LDH释放测定

采用乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒，纳米氧化锌作用24h收集细胞的上清液进行后续检测，吸光度值波长设置同1.5。

1.7 ROS水平测定

细胞按照3×105个/孔的密度接种于6孔培养板，采用活性氧检测试剂盒，纳米氧化锌作用24h收集细胞装载探针后流式细胞仪检测。

2 结果与分析

2.1 WST-1结果

如图1所示，纳米氧化锌对BEAS-2B细胞毒性作用24h IC50为13.47μg/mL；48h IC50为13.81μg/mL。

图1 WST-1检测BEAS-2B细胞纳米氧化锌作用结果

2.2 LDH释放水平

LDH释放检测结果表明，25μg/mL及以上浓度纳米氧化锌作用出现LDH释放量显著性增加。

2.3 ROS水平

胞内ROS检测结果如图2所示，6.25μg/mL浓度少量ROS增加，12.5μg/mL及25μg/mL浓度ROS大量增加，50μg/mL及以上浓度细胞全部死亡脱落。

图2 纳米氧化锌作用BEAS-2B细胞24h的ROS阳性细胞比例情况

3 结论

随着纳米氧化锌的广泛应用，其引起的环境污染风险也越来越被人们关注。Jeng与Swanson[3]研究显示纳米氧化锌的毒性作用与浓度之间存在一定的关系。关荣发等[4]研究发现纳米氧化锌对人的正常肝细胞的遗传毒性和细胞毒性均有明显的剂量效应关系。袁金华等[5]发现20μg/mL浓度的纳米氧化锌对人胚肺成纤维细胞存在强烈的毒性，细胞存活率低于10%；Lai等[6]发现浓度大于20μg/mL的纳米氧化锌作用于人胶质瘤细胞的细胞存活率不到5%，提示纳米氧化锌毒性作用可能与其浓度存在相关性。Brunner等[7]研究发现纳米氧化锌浓度大于15μg/mL时，人体皮瘤细胞和3T3纤维原细胞均全部死亡，低浓度纳米氧化锌的细胞毒性具有明显的剂量效应关系。该文研究证实12.5～100μg/mL浓度范围，纳米氧化锌对人正常肺上皮细胞BEAS-2B有剂量效应的毒性作用，染毒24h就有明显的作用，为深入研究和评价纳米氧化锌的生物学效应奠定了重要的实验基础。

很多研究显示，纳米氧化锌的毒理机制可能与氧化应激效应有关[8，9]，但截至目前，其毒性机理还有待于进一步研究。该文机制探讨表明，12.5～100μg/mL浓度范围内纳米氧化锌导致BEAS-2B胞内ROS水平和胞外LDH释放量显著增加，证实纳米氧化锌的毒性作用与氧化应激效应有密切联系。

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[4]关荣发,陈潇婷,芮昶,等.纳米氧化锌对人正常肝细胞DNA及染色体的损伤作用[J].中国药理学与毒理学杂志,2012,26(2):237-241.

[5]袁金华,李光,陈慧珍,等.纳米氧化锌对人胚肺成纤维细胞的生物毒性[J].中山大学学报:医学科学版,2009,30(2):170-174.

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Biological Effect in Vitro of Nano Zinc Oxide on Human Normal Lung Cell BEAS-2B

Yang Cai-xia1,Feng Jing1,Zhang Xiang-mei1,Ma Hui2
(1.ACEA Biological (Hangzhou) Co.Ltd.,Zhejiang Hangzhou 310030;2.China United Engineering Company,Zhejiang Hangzhou 310000)

With the wide use of Nano Zinc Oxide,its biological safety is concerned.In normal human lung epithelial cell line BEAS-2B as the research model,the biologicaltoxicityin vitro of nano Zinc Oxide cells on it was studied by using WST-1 detection technology,and the mechanism of ROS by detecting intracellular and extracellular LDH release level was explored.This study found that in the range of 12.5 to 100 g/mL,Nano Zinc Oxide had a dose-dependent toxicity effect on BEAS-2B cells,and resulted in a significant increase in ROS levels and extracellular LDH release in BEAS-2B cells.It was confirmed that the toxicity of Nano Zinc Oxide had a close relationship with the oxidative stress effect,the research results can provide an important experimental basis for further research and evaluation of the biological safety of nano - Zinc Oxide.

Nano Zinc Oxide;Cytotoxicity;Oxidative stress

R318.08；TB383.1

A

2096-0387（2016）06-0044-03

杨彩霞（1983-），女，硕士，研究方向：生物研发。