溶氧对黑曲霉产β-葡萄糖苷酶发酵的影响

肖玲玲，张超，龚大春

（1.湖北三峡职业技术学院，湖北宜昌443002；2.三峡大学，湖北宜昌443002）

溶氧对黑曲霉产β-葡萄糖苷酶发酵的影响

肖玲玲1，张超2，龚大春2

（1.湖北三峡职业技术学院，湖北宜昌443002；2.三峡大学，湖北宜昌443002）

溶氧是需氧微生物发酵控制最重要的参数之一，直接影响微生物酶活。为了研究溶氧变化对黑曲霉产β-葡萄糖苷酶的影响，采用30L全自动发酵罐，考察通气比、转速及分段控氧对发酵过程的影响。结果表明，当菌体对数生长期溶氧控制在15%，后期溶氧控制在70%时，酶活力在144h时可达12.87U/mL，比分段控氧前酶活提高了1.2倍。这表明分段控氧的发酵控制方式为需氧微生物发酵培养提供了一个新的研究方向。

溶氧控制；黑曲霉；β-葡萄糖苷酶；发酵过程

β-葡萄糖苷酶是纤维素复合酶的重要组成部分，存在于自然界许多植物、昆虫、酵母、曲霉、木霉及细菌体内，参与生物体的糖代谢，对维持生物体正常生理功能起着重要作用。在纤维素降解中能将纤维素二糖和纤维素寡糖水解成葡萄糖，对生物质的利用起着至关重要的作用。此外，β-葡萄糖苷酶在改良果汁风味[1]、果酒和茶叶增香[2]、生产低聚龙胆糖[3]、青梅脱苦[4]、生产大豆异黄酮[5]、生产天然色素[6]以及转化虎杖中白藜芦醇苷生成白藜芦醇[7]等方面也得到了广泛的应用。同时，β-葡萄糖苷酶作为多酚化合物，具有抗氧化、强化血管壁，促进肠胃消化，降低血脂肪，增加身体抵抗力，并防止动脉硬化、血栓形成等作用，是一类较好的天然抗氧化剂[8]。

本文采用30L Biostat Cplus全自动发酵罐在线监测和调节溶氧、转速等参数，研究通气比、转速、溶氧对黑曲霉菌体生长及β-葡萄糖苷酶合成的影响，以期提出较好的发酵控制方式，为黑曲霉扩大生产β-葡萄糖苷酶提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

黑曲霉（Aspergillus niger），艾伦·麦克德尔米德再生能源研究所提供；斜面培养基，PDA培养基；种子培养基，葡萄糖60g/L，麦芽粉8g/L，（NH4）2SO410g/L，KH2PO45g/L，MgSO4·7H2O 1g/L；发 酵 培养基，麦芽浸粉18g/L，酵母膏3.22g/L，KH2PO43g/L，MnSO4·H2O 0.58mM， 吐 温 -80 0.5mL/L，MgSO4·7H2O 0.23g/L，消泡剂0.5mL/L。

UV-1100紫外分光光度计，上海美谱达仪器有限公司；HH-2数显恒温水浴锅，常州国华电器有限公司；Biostat Cplus 30自动灭菌发酵罐，广州宝信捷生物应用设备有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 通气比对发酵过程的影响

装液量10L/30L，转速300rpm，pH自然，接种量10%，温度28℃，发酵6d。调节通气比（1∶1、3∶2、2∶1vvm），考察通气量对发酵过程的影响。

1.2.2 搅拌转速对发酵过程的影响

装液量10L/30L，通气比3∶2 vvm，pH自然，接种量10%，温度28℃，发酵6d。调节转速（300、350、400rpm），考察搅拌转速对发酵过程的影响。

1.2.3 分段控氧对发酵过程的影响

装液量10L/30L，pH自然，接种量10%，温度28℃，发酵6d。将转速和溶氧度联动，同时调节通气量，将菌体对数生长期溶氧控制在15%，后期溶氧分别控制在30%、50%和70%，考察分段控氧对发酵过程的影响。

1.3 菌体浓度的测定

干重法：取50mL发酵液抽滤得到菌体，将菌体放入100℃烘箱中烘干至恒重，称量并减去烘干滤纸的质量即为菌体浓度。

1.4 酶活测定方法

分光光度法[9]：取适当稀释的酶液0.5mL，加入1mL质量分数为1.0%的水杨苷溶液，50℃水浴保温30min，加入3mL DNS试剂，沸水浴10min，冷却后加水稀释到25mL，在540nm测吸光度。

β-葡萄糖苷酶活力单位的定义：在50℃，pH4.8的条件下，1min从浓度为1.0%的水杨苷溶液中释放1μmol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位。

2 结果与分析

2.1 通气比对发酵过程的影响

从图1、2、3可以看出，当通气比控制在3∶2vvm时，菌体浓度最大值可达9.42g/L，溶氧均在18h后跌0，之后开始上升。在不同通气比条件下，产酶均在42h后才开始，酶活随着时间的推移均有所上升，其中以通气量3∶2vvm时酶活最高可达5.34U/mL，但与摇瓶条件下的相差甚远。分析原因，可能是在发酵过程中，对数生长期供氧不足，有少量菌团形成，影响到黑曲霉的生长和β-葡萄糖苷酶的形成，导致酶活不高。

图1 通气比为1∶1vvm时发酵过程中的变化情况

图2 通气比为3∶2vvm时发酵过程中的变化情况

图3 通气比为2∶1vvm时发酵过程中的变化情况

2.2 搅拌转速对发酵过程的影响

从图4、5可以看出，当转速设定在350rpm时，发酵66h后酶活力急剧上升，最大可达到10.75U/mL，但溶氧在12～42h跌0（维持在5%～10%）后回升。即在对数生长期，溶氧度低于霉菌临界溶氧度（10%～15%）的时间依旧较长；当转速维持在400rpm时，菌体浓度最大可达10.14g/L，溶氧不跌0且持续上升，但酶活相对最低仅有1.38U/mL，并在发酵90h后维持恒定。分析原因，可能是由于菌体生长和酶的生成均需要氧气参与，搅拌速度过低，发酵液中溶解氧浓度不够，影响β-葡萄糖苷酶的生成；当搅拌速度过大时，虽然溶解氧浓度增大，但菌体生长速度大于产酶速度，同时过大的转速产生了较高的剪切力，使菌丝变得纤细，影响酶的生成，导致酶活很低。

图4 转速为350rpm时发酵过程中的变化情况

图5 转速为400rpm时发酵过程中的变化情况

2.3 分段控氧对发酵过程的影响

如图6、7、8所示，当后期溶氧控制在30%时，菌体浓度在发酵进行30h时达到最大，为13.54g/L，但酶活最大仅为5.6U/mL，溶氧刚开始下降，24h后上升且在30%维持72h后上升。出现这一现象的原因可能是菌体在对数生长期供氧充足，菌体生长良好，后期因供氧不足，致使酶量少，酶活低；后期溶氧控制在50%时，β-葡萄糖苷酶在36h开始形成，酶活最高时为10.95U/mL；后期溶氧控制在70%时，β-葡萄糖苷酶活最大可达到12.87U/mL，可能是由于后期供氧量的加大，使酶的合成量显著增加。

图6 后期溶氧控制在30%时发酵过程中的变化情况

图7 后期溶氧控制在50%时发酵过程中的变化情况

图8 后期溶氧控制在70%时发酵过程中的变化情况

3 结论

该文对黑曲霉产β-葡萄糖苷酶发酵过程中的溶氧控制进行了研究。结果显示，转速与通气比对黑曲霉的生长与β-葡萄糖苷酶的合成均有影响，相比而言，转速与溶氧联动，同时调节通气比的分段控氧模式更有利于提高菌体生物量与β-葡萄糖苷酶酶活。当前期溶氧自然，对数生长期溶氧浓度控制在15%，后期溶氧控制在70%时，酶活可达到12.87U/mL，是优化通气比和搅拌转速后产酶酶活的1.2倍。本研究从发酵过程中的一个化学参数——溶氧控制入手，探索出了分段控氧方式，为提高需氧微生物的生物量与产品产量提供了一条新思路。

[1]Gueguen Y,Chemardin P,Janbon G,et al.A very efficient β-glucosidase catalyst for the hydrolysis of flavor precursors of wines and fruit juices[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,1996,44(8):2336-2340.

[2]Takeo T.Production of linalool and geraniol by hydrolytic breakdown of bound forms in disrupted tea shoots[J].Phytochemist ry,1981,120(9):2145-2147.

[3]刘玲玲,朱松,朱婷,等.重组β-葡萄糖苷酶生产龙胆低聚糖的工艺条件优化[J].微生物学报,2009,49(5):597-602.

[4]陶宇萍.苦杏仁苷酶在纯天然青梅果汁中的应用[D].南京:南京农业大学,1993.

[5]齐斌,刘贤金.产大豆异黄酮β-葡萄糖苷酶菌株的筛选及酶学性质研究[J].食品科学,2007,28(8):290-293.

[6]吴志梅,梁华正,李佳春,等.产β-葡萄糖苷酶菌株的筛选及发酵栀子蓝色素的研究[J].现代食品科技,2005,21(3):53-54.

[7]Corma A,Iborra S,Velty A.Chemical Routes for the Transformation of Biomass into Chemicals[J].ChemInform,2007,38(36):2411-2502.

[8]李远华.β-葡萄糖苷酶的研究进展[J].安徽农业大学学报,2002,29(4):421-425.

[9]全国食品工业标委会工业发酵分委会.QB2583-2003纤维素酶制剂[S].北京:中国轻工业出版社,2004.

Effect of Dissolved Oxygen Control on β-glucosidase Produced by Aspergillus niger

Xiao Ling-ling1,Zhang Chao2,Gong Da-chun2
(1.Hubei Three Gorges Polytechnic,Hubei Yichang 443002;2.China Three Gorges University,Hubei Yichang 443002)

Aerobic microbial fermentation control of dissolved oxygen is one of the most important parameters directly affect the enzyme activity.In order to study the change of dissolved oxygen of β-glucosidase produced by Aspergillus niger,using 30L full automatic fermentation tank,the effects of aeration ratio,rotating speed and sectional oxygen control on the fermentation process was investigated.The results showed that when the logarithmic dissolved oxygen control in 15%,later dissolved oxygen control in 70%,the enzyme activity could reach 12.87U/mL in 144 hours,the enzyme activity was increased by 1.2 times than that of the sectional control.This indicates that the fermentation control mode of staged oxygen control of the aerobic fermentation of aerobic fermentation provides a new research direction for the fermentation of aerobic microorganisms.

Dissolved oxygen;Aspergillus niger;β-glucosidase;Fermentation process

TQ920.1

A

2096-0387（2016）06-0018-04

肖玲玲（1983-），女，湖南常德人，硕士，讲师，研究方向：生物化工。