MicroRNA-218下调肝细胞癌中的E2F2基因表达抑制细胞增殖的研究

王涛　马思聪　戚星星　汤晓寅　崔丹　王智　池嘉昌　李萍　翟博

200127　上海交通大学医学院附属仁济医院肿瘤介入科



·论著·

MicroRNA-218下调肝细胞癌中的E2F2基因表达抑制细胞增殖的研究

王涛马思聪戚星星汤晓寅崔丹王智池嘉昌李萍翟博

200127上海交通大学医学院附属仁济医院肿瘤介入科

【摘要】目的探讨MicroRNA-218(miRNA-218)下调肝细胞癌中的E2F2基因表达，从而抑制细胞增殖的机制。方法从细胞库中取得人类肝癌细胞株HepG2、Huh7、MHCC-97H、BEL-7402和正常肝细胞株L02。随后进行细胞培养和转移、反转录多聚酶链反应、免疫印迹分析、细胞增殖和集落形成试验、细胞周期分析和相应的统计学处理。结果miR-218表达水平在癌细胞中下调。MTT生长曲线表明,当miR-218过度表达时(Huh7中的miR-218 P=0.001;在 MHCC-97中的miR-218 P=0.013)细胞增殖能力明显降低。双荧光素酶实验证实，转染了miRNA-218模拟物的细胞的荧光素酶活性显著降低(P<0.01)，荧光酶报告基因含有E2F2野生型的第3′非翻译区。这些结果表明E2F2是 miR-218的直接作用对象。与阴性对照组相比,转染了miR-218 模拟物的Huh7和 MHCC-97细胞株中的E2F2的相对mRNA表达显著下调(P<0.05)。结论miR-218通过直接作用于E2F2基因的第3′非翻译区调节E2F2的表达，从而抑制HCC细胞增殖。

【关键词】MicroRNA-218；肝细胞癌；E2F2基因；细胞增殖

MicroRNAs(miRNAs)可以有效调节各种生物过程,包括细胞增殖、迁移、分化和细胞凋亡。研究表明，miRNAs的调节异常与各种类型人类癌症的发生和发展密切相关，而miR-218与肿瘤发病机制和各种类型癌症的形成相关[1-2]。miR-218的表达下调,可能作为细胞瘤、透明细胞性肾细胞癌和胃癌、鼻咽癌、宫颈癌、乳腺癌、口腔癌和小细胞肺癌的一种潜在的肿瘤抑制剂[3]。目前的研究都是基于假设与正常肝细胞相比，miR-218在肝癌细胞中表达下调,从而诱导细胞周期阻滞于G0/G1期检查点，恢复miR-218可抑制细胞增殖[4]。本研究将在此基础上进一步分析，旨在提供较为直接依据表明miR-218作用于E2F2来调节其在肝癌细胞中的表达。

资料和方法

一、细胞培养和转移

从中国科学院(上海)的细胞库中取得人类肝癌细胞株HepG2 Huh7,MHCC.97H BEL.7402和正常肝细胞株L02。将这些细胞株培养在37 ℃、二氧化碳浓度低于5%、含10%胎牛血清(Gibco.BRL)的良伊格尔培养基(Gibco.BRL,Invitrogen Life Technologies,卡尔斯巴德、CA、美国)中。miR-218的模拟物和阴性对照(NC) 购自上海GenePharma有限公司。根据制造商的指导说明，利用Lipofectamine 2000(生命表达载体技术)进行miRNA的瞬时转染分析。

二、反转录多聚酶链反应(RT-qPCR)。

使用TRIzol试剂(英杰公司)从培养的细胞中提取RNA。测量miR-218的表达水平使用TaqMan MicroRNA反转录工具包(pplied Biosystems, Life Technologies, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)合成互补脱氧核糖核酸。使用TaqMan微分析工具包(应用生物系统公司)测量miR-218和内源性控制的U6的表达水平。使用7500 实时PCR系统(应用生物系统公司)、SYBR Premix Ex Taq(豆类生物技术有限公司)并以β-actin作为内部控制进行RT-qPCR实验分析。引物由GeneCore生物技术有限公司(上海)设计并合成，序列如下:E2F2开头,5′CGT CCC TGA GTT CCC AAC C3′和反向序列,5′GCG AAG TGT CAT ACC GAG TCT T3′; 和β-actin开头,5′AGG CAC CAG GGC GTG AT3′和反向序列,5′TGC TCC CAG TTG GTG ACG AT3′。每个样本一式3份。

三、免疫印迹分析

使用放射免疫沉淀法从细胞中提取蛋白质，并用考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度。使用8% 的SDS-PAGE分离等量的蛋白质，然后将其转移到聚偏氟乙烯膜中。加入5%脱脂奶阻滞后,细胞膜用兔抗人E2F2多克隆抗体(1∶200;sc-632;Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, USA)在4 ℃的环境下培养整夜。随后用吐温20(TBST;Sigma-Aldrich)0.9%氯化钠溶液(Affymetrix公司)冲洗,在室温下，用辣根过氧化物酶标记的二级山羊抗兔免疫球蛋白G抗体 (1∶1 000; Santa Cruz Biotechnology, Inc.)培养1 h。用TBST再次清洗，可用化学发光法检测到蛋白带。使用化学发光成像系统捕捉数字图像。β-actin被用作蛋白质加载控制剂。蛋白质片段的浓度使用Quantity One软件4.5.0版本测量获得。

四、细胞增殖和集落形成试验

用MTT法检测细胞增殖，然后分别将Huh7和MHCC-97H转染NC-miR-218基因48 h,将细胞培养在96个孔中，每个孔中放入3000个细胞。然后将细胞分别培养12、24、36和48 h,在每个孔中加入20 μL MTT，37 ℃培养4 h,将细胞溶解在150 μL二甲亚砜中，490 nm测量吸光度评估细胞增殖。针对集落形成试验,将400个细胞放置到6个培养井中，并在37 ℃培养,直到细胞增长到可见的菌落。使用磷酸盐缓冲盐水(PBS)冲洗该菌落两次,使用甲醇(Sigma-Aldrich)固定和用0.1%结晶紫(Sigma-Aldrich)标记,然后统计每口井中的菌落数量。所有实验执行三次。

五、细胞周期分析

Huh7和 MHCC-97H细胞培养在60 cm的培养皿中，并分别用NC、miR-218放置一夜。PBS洗涤3次,在37 ℃的环境下，将这些细胞培养在100 μL核糖核酸酶(南京凯基生物技术有限公司)中30 min，并在400 μL 碘化丙啶(南京凯基生物技术有限公司)中额外浸染30 min。然后使用BD FACSCalibur细胞分析仪(BD生物科学,富兰克林湖,新泽西,美国)对样品进行细胞周期分析。

六、双荧光素酶实验。

使用MicroRNA的目标预测工具米兰达(http://www.microrna.org)评估miR-218的目标基因。为了检测E2F2是否为miR-218的直接下游靶基因，进行了双荧光素酶报告分析实验。E2F2野生型(WT)的第3非翻译区，包含miR-218的潜在结合位点和相应E2F2的突变第3′非翻译区被克隆到psiCheck2双荧光素酶报告基因中。将Hug7细胞暂时转染含有第3′非翻译区的报告基因，使用Pikkagene双荧光素酶报告实验系统(TOYOB-Net有限公司,东京,日本)报告后转录miR-218模拟物及阴性对照48 h后的荧光素酶活性。

七、统计学处理

采用SPSS 19.0统计软件进行分析，计量资料采用均数±标准差表示。对两组之间的差异性进行分析,并在超过两组以上分别使用t检验和单因素方差分析。所有统计分析进行双侧检验,P<0.05为差异有统计学意义。

结果

一、miR-218表达在人肝癌细胞株中下调

在进行RT-qPCR实验以确定miRNA在四个肝癌细胞系(Huh7、MHCC-97H、HepG2和BEL-7402)中的表达,并与在人类正常肝细胞株(L02)的表达相对比。如图1所示,miR-218在人类肝癌细胞中的表达水平显著下调。此外,与HepG2和BEL-7402细胞相比，Huh7和 MHCC-97H细胞中的miR-218表达水平更低。这些结果表明miR-218可用于抑制肝癌细胞。

二、miR-218抑制HCC细胞的增殖

如图2所示,通过MTT法测量细胞活性。 MTT生长曲线表明,当miR-218过度表达时(Huh7中的miR-218P=0.001;在 MHCC-97中的miR-218P=0.013)细胞增殖能力明显降低。此外, 菌落集落形成试验表明,转染了miR-218模拟物的细胞菌落数量明显低于未转染者。

三、miR-218诱导细胞周期(G0/G1阶段)停滞

流式细胞术分析表明,在G0/G1阶段转染了miR-218的 Huh7 和MHCC-97H细胞的百分比分别为16%(Huh7)和13%(MHCC-97H)，明显高于阴性对照组,这与在S期细胞比例分别削减18%(Huh7)和23%(MHCC-97H)相一致。双荧光素酶实验证实，转染了miR-218模拟物的细胞的荧光素酶活性显著降低(P<0.01)，萤光素酶报告基因含有 E2F2基因的WT 第3′非翻译区。这些结果表明E2F2是 miR-218的直接作用对象。与阴性对照组相比,转染了miR-218 模拟物的Huh7和 MHCC-97细胞株中的E2F2相对mRNA表达显著下调(P<0.05)。这与RT-qPCR的结果相一致,免疫印迹分析表明，转染了miR-218的Huh7和MHCC-97细胞中的E2F2蛋白表达显著降低(P<0.05)。见图3。

A:miRNA-218在Huh7、MHCC-97H、HepG2、BEL-7402中的表达;B:Huh7细胞中的miR-218表达水平C:MHCC-97H细胞中的miR-218表达水平；*P<0.05，**P<0.01

图1miRNA-218在四个肝癌细胞系(Huh7、MHCC-97H、HepG2、BEL-7402)中的表达

A:Huh7和MHCC-97H细胞中的miR-218 在490 nm吸光值；B:Huh7和MHCC-97H细胞中的miR-218拷贝数

A:Huh7和MHCC-97H细胞中的E2F2基因表达水平；B:Huh7和MHCC-97H细胞中的E2F2基因表达水平(Western-blot)；C:Huh7和MHCC-97H细胞中的E2F2蛋白表达水平

图3MicroRNA-218下调肝细胞癌中的E2F2基因表达

讨论

普遍认为miRNAs可以调节多种生物进程,包括肿瘤。目前的研究表明了miR-218在肝癌细胞中的表达及如何在分子机制上发挥它们的功能[5,6]。本研究结果表明,miR-218表达水平在肝癌细胞中下调,这与以前的研究结果一致[7]。本研究选取Huh7和MHCC-97H细胞，进行MTT和集落形成试验，结果显示，转染了miR-218模拟物的肝癌细胞与对照组相比，表现出较弱的增殖能力。此外,发现miR-218的过度表达诱导细胞周期阻滞于G0 / G1期。因此推断miR-218有肿瘤抑制功能。为了进一步分析miR-218抑制肝癌细胞增殖的分子机制，本研究进行了基于生物信息学的预测和双荧光素酶报告实验,E2F2被确定为miR-218的直接作用对象。RT.qPCR和免疫印迹分析结果显示，miR-218的上调可以下调E2F2的 mRNA和蛋白表达水平。这些结果表明，miR-218通过直接作用于E2F2基因的第3′非翻译区调节E2F2的表达，从而抑制肝癌细胞的增殖。

作为主要的细胞周期调控剂，E2F蛋白质在细胞周期信号转导通路的下半游起作用，对细胞周期进展中的细胞增殖及生长起至关重要的作用。E2F2作为 E2F的一种,激活E2F靶基因的转录和调控G1 / S段相变。在正常的细胞周期控制中，细胞周期蛋白质依赖激酶类(CDKs)的磷酸化作用是至关重要的,其导致Rb类蛋白质的磷酸化[7-9]。Rb随后激活E2Fs并允许G1 / S的相变[10,11]。有研究报道miR-218抑制结肠癌中CDK4的表达。基于这些因素,可以假设miR-218调节E2F2的表达;这种调节不仅通过直接针对E2F2起作用，还通过抑制CDK4的表达,还需要进一步的研究来验证这个假设。

参考文献

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(本文编辑：易玲)

Study on microRNA-218 inhibiting proliferation of hepatocellular carcinoma cell by down-regulating E2F2 gene expression

WANGTao,MASi-cong,QIXing-xing,TANGXiao-yin,CUIDan,WANGZhi,CHIJia-chang,LIPing,ZHAIBo.

DepartmentofInterventionalOncology,RenjiHospital,SchoolofMedicine,ShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai200127,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the mechanism for microRNA-218 (miR-218) dampening E2F2 gene expression to inhibit proliferation in hepatocellular carcinoma (HCC). MethodsHCC cell lines (HepG2, Huh7, MHCC.97H and BEL.7402) and normal hepatocyte cell line L02 were obtained from cell bank, which were subjected for reverse transcription-polymerase chain reaction, immunoblot analysis, cell proliferation and colony formation test, cell cycle analysis and relevant statistics analysis. ResultsThe miR-218 level was down-regulated in cancer cells (P<0.05). The growth curve of MTT indicated that proliferative capacity of cells was significantly reduced in miR-218-overexpressed cells (Huh7: P=0.001; MHCC.97: P=0.013). These results revealed that E2F2 was the direct target of miR-218. In comparison to control group of L02, the relative mRNA of E2F2 in Huh7 and MHCC.97 cell lines transfected with the stimulant of miR-218 was significantly down-regulated (P<0.05). ConclusionmiR-218 can directly act on the 3' untranslated region of E2F2 gene to inhibit the development of HCC.

【Key words】MicroRNA-218; Hepatocellular carcinoma; E2F2; Cell proliferation

(收稿日期：2015-10-15)

Corresponding author:ZHAI Bo, Email:zhaiboshi@sina.com

通信作者：翟博，Email：zhaiboshi@sina.com

基金项目：国家自然科学基金(青年项目，81201678)；国家自然科学基金(面上项目，81472845)