脂肪酶产生菌的筛选及基因的克隆表达

赵　雪，宋文刚，兰　英

(1.北华大学药学院，吉林 吉林　132013；2.北华大学基础医学院，吉林 吉林　132013；3.中国科学院微生物研究所，北京　100101)



脂肪酶产生菌的筛选及基因的克隆表达

赵雪1，宋文刚2，兰英3

(1.北华大学药学院，吉林 吉林132013；2.北华大学基础医学院，吉林 吉林132013；3.中国科学院微生物研究所，北京100101)

摘要：目的 筛选出脂肪酶活性较高菌株，通过脂肪酶基因克隆技术获得高表达的脂肪酶，根据酶活曲线确定该酶的最适温度和最适pH.方法 采用透明圈法，以三丁酸甘油酯为底物筛选脂肪酶活性较高菌株；通过PCR 扩增获得其脂肪酶基因Pseudomonas peli(PP)序列，构建pET-28 a表达载体，并在大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中进行异源表达；通过Ni柱将脂肪酶纯化，并根据酶活曲线确定该酶的最适温度和最适pH.结果 筛选到一株脂肪酶活性较高的菌株，16S rRNA 基因序列比对结果初步鉴定为Pseudomonas peli.PCR扩增得到的基因片段长度为801 bp，其序列与Pseudomonas peli中的脂肪酶基因序列相似性达到100%，PP基因在大肠杆菌中异源表达蛋白的分子量约29 KD，该蛋白在55 ℃、pH 7.0时活性最高.结论 通过基因克隆表达后得到的脂肪酶Ni柱纯化后纯度达95%以上，且耐高温，为脂肪酶工业化应用奠定了基础.

关键词：脂肪酶；筛选；基因克隆；纯化

【引用格式】赵雪，宋文刚，兰英.脂肪酶产生菌的筛选及基因的克隆表达[J].北华大学学报(自然科学版)，2016，17(2)：186-190.

脂肪酶(Lipase EC 3.1.1.3)为三酰甘油水解酶，是一类催化、合成和分解长链脂肪酸酯的酶类.脂肪酶广泛存在于动物、植物及微生物中，由细菌和真菌产生的脂肪酶具有催化活性多样性、生产周期短、生产成本低、稳定性好等优点，因此成为商品化脂肪酶的主要来源.此外，脂肪酶在一些重要光学活性化合物的拆分与合成时具有极高的立体选择专一性[1-2]，因而是一种重要的工业用酶.脂肪酶主要应用于脂肪加工、皮革、化妆品、纺织品、乳制品、洗涤剂及造纸工业等[3-4],此外，脂肪酶还用于生物多聚体和生物柴油等化学品的合成.传统方法一般采用诱变野生菌的方法进行筛选，粗酶的提纯耗时较长，人员投入及工作量较大，成本高，所以用基因工程方法生产脂肪酶已成为首选方法[5].目前，基因工程方法生产的微生物来源的脂肪酶主要集中于根霉属、青霉属、曲霉属、毛霉属、地酶属、假丝酵母属、伯克霍尔德菌属、假单胞属等有工业应用价值的菌株.大多数脂肪酶的最适作用温度为30～50 ℃[6]，只有个别细菌脂肪酶最适作用温度为65 ℃，如洋葱伯克霍尔德菌ZYB002[7]，而在应用广泛的假单胞菌属脂肪酶中尚未发现耐高温脂肪酶产生菌.

本文采用透明圈法，以三丁酸甘油酯为底物筛选到一株脂肪酶活性较高菌株，16S rRNA 基因序列比对结果初步鉴定为Pseudomonaspeli，通过PCR 扩增获得其脂肪酶基因Pseudomonaspeli(PP)序列，构建pET-28a表达载体，并在大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中进行异源表达；通过Ni柱将脂肪酶纯化，并根据酶活曲线确定该酶的最适温度和最适pH，通过与其他已报道脂肪酶相比较具有耐高温特点，为下一步脂肪酶的工业化应用奠定了基础.

1实验材料

1.1菌株与质粒

候选菌株由本实验室从西宁湟水河淤泥中分离培养得到.菌株E.coliDH5ɑ和E.coliBL21(DE3)(北京索莱宝科技有限公司)；质粒pET-28ɑ和pMD-19T(北京智杰方远科技有限公司).

1.2实验试剂

三丁酸甘油酯(北京宝如亿生物技术有限公司)；2X Taq PCR MasterMix(北京天根生物有限公司)；BamHⅠ、HindⅢ 限制性内切酶、SolutionⅠ DNA连接酶(北京六合通经贸有限公司)；DNA凝胶回收试剂盒(北京中科助研科技有限公司)；质粒小提试剂盒(北京华力德科技有限公司)；DNA marker (北京博迈德生物科技有限公司)；卡那霉素(北京索莱宝科技有限公司)；IPTG 诱导剂(北京盛世前尘生物科技有限公司)；TEMED(北京拜尔迪生物技术有限公司).

1.3培养基及溶液配制

LB液体培养基配制：胰蛋白胨(Tryptone)10 g、酵母提取物(Yeast Extract)5 g、氯化钠(NaCl)10 g，加蒸馏水至1 L，调pH至7.0，121 ℃高压灭菌30 min.

LB固体斜面培养基：胰蛋白胨(Tryptone)10 g、酵母提取物(Yeast Extract)5 g、氯化钠(NaCl)10 g、琼脂(Agar)、加蒸馏水至1 L，调pH至7.0，121 ℃高压灭菌30 min.

三丁酸甘油酯培养基：胰蛋白胨(Tryptone)10 g、酵母提取物(Yeast Extract)5 g、氯化钠(NaCl)10 g，琼脂(Agar)、98%三丁酸甘油酯11 mL，调pH至7.0，加蒸馏水至1 L，121 ℃高压灭菌30 min，超声30 min，倒板备用.

lysis buffer：150 mmol NaCl+25 mmol Tris-HCl，pH 8.0；Washing buffer：lysis+20 mmol咪唑；Eluting buffer：lysis+250 mmol咪唑.

1.4实验仪器

超净工作台(TELSTAR BV-30/70)；离心机(Beckman Coulter Microfuge 22R)；纯水仪(ELGA LabWater PURELAB Flex)；PCR仪(SensoQuest LabCycler DP-88)；电热恒温培养箱(ZDP-2270)；水浴锅(DK-8D).

2实验方法

2.1脂肪酶产生菌的筛选

挑选60株候选细菌，分别接种于固体LB平板培养基，30 ℃培养过夜，次日挑取单菌落分别接种于50 mL液体培养基中30 ℃扩大培养.用打孔器将事先配制好的三丁酸甘油酯平板培养基打孔，每孔加入同样浓度的菌液30 μL，30 ℃培养38 h后测量每孔透明圈直径.

2.2DNA提取及16S初步鉴定

DNA提取采用Takara DNA提取试剂盒，具体操作详见试剂盒操作说明书.16S初步鉴定：用提取基因组DNA扩增其16S rRNA片段，扩增后片段在http：//www.ezbiocloud.net/网站进行比对.

2.3引物设计与合成

查找PP脂肪酶基因序列，利用引物设计软件Primer5根据PP基因序列来设计引物(包括BamHⅠ和Hind Ⅲ 限制性酶切位点)，上游引物：GGATCCTCAGGGTTCGAGCGGC；下划线表示BamHⅠ酶切位点；下游引物：AAGCTTCATGTCCA GATTCTTCAGCCTT；下划线表示HindⅢ 酶切位点(由上海生工生物有限公司合成).

2.4脂肪酶基因克隆

以基因组DNA为模板，利用上述合成引物进行PCR扩增，扩增条件为：94 ℃预变性5 min，94 ℃加热变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，反应进行30个循环，延伸10 min后终止反应.扩增完成后用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，利用凝胶回收试剂盒将电泳片段回收.根据PCR产物的量计算连接用载体的量，16 ℃连接过夜.将连接产物转到感受态细胞E.coli DH5ɑ，37 ℃孵箱培养12～16 h.

挑取蓝白斑筛选后的阳性克隆，进行菌落PCR.然后通过1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，挑取PCR鉴定为阳性的克隆接种于液体LB培养基中，于37 ℃、200 r/min过夜培养.

2.5构建重组质粒

过夜培养菌株离心后，用质粒小提试剂盒提取质粒.将带有目的基因的质粒与pET-28ɑ载体用限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ 进行双酶切.双酶切体系：BamHⅠ 1 μL；HindⅢ 1 μL；10×buffer K 5 μL；质粒15 μL；加去离子水至50 μL，37 ℃反应3 h.将酶切产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，电泳产物经过DNA回收试剂盒回收纯化；纯化后目的基因与pET-28ɑ质粒进行连接.连接体系：SolutionⅠ 7 μL；DNA 4 μL；pET-28ɑ 3 μL，16 ℃连接过夜，将连接产物转到感受态细胞E.coliDH5ɑ，将适当体积已转化的感受态细胞涂布到含卡那霉素的固体LB平板上，37 ℃孵箱倒置培养12～16 h.

2.6构建重组菌

取2.5中过夜培养的菌液2 mL，12 000 r/min 离心3 min，弃去上清，菌体用质粒小提试剂盒提取质粒，酶切验证后将重组质粒送至北京诺赛基因有限公司测序，确定插入位点的正确性.将测序验证的表达质粒转化到E.coliBL21(DE3)感受态细胞，构建表达菌株rePP.

2.7脂肪酶rePP表达、纯化

挑取重组菌rePP/E.coliBL21(DE3)，加入LB培养基(含100 mg/mL卡那霉素)中，37 ℃摇床培养至OD600为0.6；加入诱导剂IPTG(终浓度为0.5 mmol)，26 ℃诱导过夜；8 000 r/min离心10 min，收集菌体，加入 lysis buffer缓冲液(菌体加6 mL/g缓冲液)，超声波破碎10 min，12 000 r/min离心10 min，收集上清，即为PP粗酶液.将粗酶液经过12 000 r/min离心10 min，取上清加入到镍柱中进行纯化.

土地执法困境成因分析（吴桐） .....................................................................................................................3-45

2.8脂肪酶活性测定及最适条件选择

2.8.1脂肪酶活性测定

脂肪酶活性测定采用对硝基苯酚法.将对硝基苯酚(p-NP)稀释成适当浓度梯度，于410 nm处测定吸光度，绘制吸光度-浓度曲线.脂肪酶活力单位定义为：在一定条件下，每分钟释放出1 μmol对硝基苯酚的酶量定义为1个脂肪酶活力单位(U).

2.8.2最适温度检测

利用对硝基苯酚法，选取25～70 ℃范围，每间隔5 ℃，分别测定不同温度的脂肪酶的活性.

2.8.3最适pH检测

选取pH 6.0～9.5范围内，每间隔pH 0.5在最适温度下分别测定脂肪酶活性，计算脂肪酶rePP的最适pH.

3实验结果

3.1脂肪酶产生菌筛选及16S rRNA结果

依据2.1产脂肪酶菌株的筛选方法，利用三丁酸甘油酯培养基从60株菌中筛选活性较好的菌株，结果如图1，其中透明圈最大的菌株为产脂肪酶活性最高菌株.16S rRNA 片段扩增后在http：//www.ezbiocloud.net/比对，序列与PseudomonaspeliR-20805，Genebank登录号为AM114534，相似度为99.12%.

3.2脂肪酶基因PCR扩增结果

PCR扩增后经过1%琼脂糖凝胶电泳检测，得到801 bp左右的脂肪酶基因，图2为1%琼脂糖凝胶电泳检测图.

3.3T载体阳性克隆子筛选

挑取4个克隆子，进行菌落PCR筛选阳性克隆子，图3为菌落PCR鉴定电泳图，挑取的4个克隆子中两个为阳性克隆子，另外两个为阴性.

3.4重组菌阳性克隆子筛选及鉴定

挑取重组菌单个克隆，进行菌落PCR筛选阳性克隆，图4为菌落PCR鉴定电泳图，挑取的单个克隆全部为阳性克隆.测序公司测序结果也进一步证明目的片段插入位点正确，可以直接转入表达菌株.

3.5重组脂肪酶表达纯化

纯化的重组脂肪酶通过SDS-PAGE电泳得到一条电泳带，其分子量大小约为29 KD左右(图5)，与预测的分子量大小一致，重组的脂肪酶已经过Ni柱纯化.

3.6脂肪酶活性测定

通过对硝基苯酚绘制吸光度-浓度曲线y=0.031 34x-0.005 69，R2= 0.994 61，37 ℃，pH 8.0测定表达后脂肪酶活性，其活性单位约为23 750 U/g.

3.7最适温度与最适pH

在不同温度和不同pH条件下测定脂肪酶反应的吸光度，根据吸光度测定计算脂肪酶活性，发现其在55 ℃、pH 7.0时活性最高.图6为脂肪酶最适温度结果，图7为脂肪酶最适pH结果.

4讨论

为减少化学试剂对环境的影响，脂肪酶渐渐成为必不可少的工业用酶.酶的开发和应用具有一定的市场前景，从2004 年起全球工业用酶产值高达 20 亿美元，并且年平均增长率为 4%～5%[8].基因工程技术和新生产技术的联合使用改善了工业用酶的性能，降低了生产成本，提高了产品质量.

Apriny等[9]整理了微生物脂肪酶的核苷酸、蛋白质及晶体结构等有关信息，提出了脂肪酶分类方法，这种方法将脂肪酶分为8个家族，即True lipase(Family Ⅰ)，The GDSL family，Family Ⅲ，The hormoe-sensitive lipase(HSL)family，Family V-VⅢ，其中True lipase又包括7个亚族FamilyⅠ.1～Family Ⅰ.7，该家族成员较多，序列差异较大，主要包括假单胞菌属脂肪酶，而文中所研究的脂肪酶就是这个家族的一员.多数细菌脂肪酶的最适作用温度和pH范围为35～45 ℃和8.0～9.0.Zheng等[7]发现洋葱伯克霍尔德菌ZYB002全细胞脂肪酶最适温度达65 ℃，而其他种属的细菌脂肪酶尚未发现最适温度为50 ℃以上的脂肪酶，本文中假单胞菌脂肪酶最适温度达到了55 ℃，粗酶在最适温度下活性为421 U/mL，经计算菌体酶活约为25.26 U/mL，而洋葱伯克霍尔德菌ZYB002全细胞脂肪酶虽然耐高温，但在最适温度下活性仅为22.8 U/mL，并且洋葱伯克霍尔德菌为条件致病菌，不宜应用于医药或食品工业.本文中所研究的脂肪酶在55 ℃高温下体现较高活性，且在70 ℃下仍保留70%活性，可以成为高温下应用于医药或食品工业的首选酶，同时为其他高温下水解或转酯反应的研究奠定了基础.另外，探索新型的固定化技术，提高酶的利用率，也成为解决工业用酶的重点.因此，为了满足工业用酶市场需求，我们必须加快对微生物脂肪酶研究与开发，同时积极拓展微生物脂肪酶应用领域.

参考文献：

[1] Gupta R，N Gupta，P Rathi.Bacterial lipases：an overview of production，purification and biochemical properties[J].Appl Microbiol Biotechnol，2004，64：763-781.

[2] Manfred T Reetz，K E Jaeger.Overexpression，immobi- lization and biotechnological application ofPseudomonaslipases[J].Chemistry and Physics of Lipids，1998，93(1-2)：3-14.

[3] Bornscheuer U T，Bessler C，Srinivas R，etal.Optimizing lipases and related enzymes for efficient application[J].Trends in Biotechnology,2002，20(10)：433-437.

[4] Jaeger K E，Reetz M T.Micorbial lipases form versatile tools for biotechnology[J].Trends Biotechnol,1998，16(9)：396-403.

[5] 贾建波，李相前，胡敏，等.脂肪酶基因在枯草芽孢杆菌中的表达及表达产物性质的研究[J].中国生物工程杂志，2008，28(1)：25-29.

[6] 黄璜，李宗军，王远亮，等.各类微生物脂肪酶酶学性质及应用的研究进展[J].粮油食品科技，2014，22(1)：109-118.

[7] Shu Zhengyu，Wu Jiguang，Cheng Lanxing，etal.Prod- uction and characteristics of the whole-cell lipase from organic solvent tolerant burkholderia sp.ZYB002[J].Microbiology，2012，166：536-548.

[8] Hasan F，Shah A，Hameed A.Industrial applications of microbial lipases[J].Enzyme and Microbial Technology，2005，28：1- 27.

[9] Apriny J L，Jaeger K E.Bacterial lipolytic enzymes：classification and properties[J].Biochem J，1999，343：177-183.

【责任编辑：陈丽华】

Isolation of Lipase-producing Strain and the Cloning Expression ofPseudomonasPeli

Zhao Xue1，Song Wengang2，Lan Ying3

(1.PharmacyCollegeofBeihuaUniversity，Jilin132013，China；2.SchoolofBasicMedicine，BeihuaUniversity，Jilin132013，China；3.InstituteofMicrobiology，ChineseAcademyofSciences，Beijing100101，China)

Abstract：ObjectiveTo isolate lipase-producing strains from mud，to clone and characterize the lipase gene，and to determine the optimum temperature and pH.MethodHigh activity lipase-producing strains were screened using tributyrin as substrate by transparent ring method.Lipase gene sequence of Pseudomonas peli(PP)was obtained by PCR amplification using the genomic DNA as template.The expression plasmid pET-28a-PP(rePP)was constructed and expressed in Escherichia coli BL21(DE3).Lipase enzyme was purified by Ni column，and the optimum temperature and pH were determined according to the activity curve.ResultsA high lipase activity strain was isolated，and was preliminarily identified as Pseudomonas peli.The fragment obtained from PCR amplification was 801 bp，which shared 100% sequence identity with that from PP.The protein of PP was expressed in E.coli BL21(DE3)with the molecular of 29 KD.The purified recombinant enzyme showed high lipolytic activity at temperature 55 ℃ and pH 7.0.ConclusionThe PP gene was obtained，and the over expression protein with high lipolytic activity was obtained in this study，which maybe widely used in industry.

Key words：lipase；isolation；gene cloning；purification

中图分类号：Q78

文献标志码：A

作者简介：赵雪(1990-)，女，硕士研究生，主要从事药物化学研究，E-mail：365786049@qq.com；通信作者：宋文刚(1968-)，男，博士，教授，硕士生导师，主要从事药物化学研究，E-mail：bhdx@vip.sina.com；兰英(1968-)，女，博士，副研究员，主要从事微生物学研究，E-mail：lanying@im.ac.cn.

基金项目：中国科学院院地合作项目；国家高技术研究发展计划(863计划)项目(2012AA02A702).

收稿日期：2015-11-03

文章编号：1009-4822(2016)02-0186-05

DOI：10.11713/j.issn.1009-4822.2016.02.009