牛磺酸抗心肌成纤维细胞增殖作用的实验研究

王立英，苏海燕，李春颖，吴殿秀，刘楠楠

(1.北华大学基础医学院，吉林 吉林　132013；2.吉林省肿瘤医院，吉林 长春　130021)



牛磺酸抗心肌成纤维细胞增殖作用的实验研究

王立英1，苏海燕2，李春颖1，吴殿秀1，刘楠楠1

(1.北华大学基础医学院，吉林 吉林132013；2.吉林省肿瘤医院，吉林 长春130021)

摘要：目的 研究牛磺酸(Taurine，Tau)对血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)诱导新生大乳鼠心肌成纤维细胞(myofibroblasts，myoFbs)增殖的抑制作用，并探讨其作用机制.方法 用AngⅡ诱导新生大乳鼠myoFbs增殖，建立心肌纤维化(myofibrosis，MF)模型.采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞增殖；羟脯氨酸试剂盒检测胶原含量；免疫细胞化学染色检测p-PKCα的膜转位及表达；Western blot检测p-PKCα和p-ERK1/2蛋白表达及含量.结果 Tau(30，60，120)mmol/L可明显抑制AngⅡ诱导的MyoFbs增殖及胶原合成，同AngⅡ组比较差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)，并且呈现出剂量依赖性.应用免疫细胞染色Western blot并且结合图像分析，结果表明：Tau可抑制p-PKCα膜转位和表达，与AngⅡ组相比差异具有统计学意义(P<0.01).结论 Tau可能通过减少p-PKCα的表达及膜转位，从而抑制MyoFbs增殖和胶原含量的增加，抑制MF，逆转心肌重塑.

关键词：牛磺酸；心肌成纤维细胞；血管紧张素Ⅱ；蛋白激酶Cα；细胞外信号调节激酶1/2

【引用格式】王立英，苏海燕，李春颖，等.牛磺酸抗心肌成纤维细胞增殖作用的实验研究[J].北华大学学报(自然科学版)，2016，17(2)：200-204.

Tau又称β-氨基乙磺酸，是机体内含量非常丰富的氨基酸，具有防病治病的多种生理功能.迄今为止，已发现Tau具有促进婴幼儿智力和脑组织的发育、防止心血管病、增强人体免疫、调节晶体渗透压、调节Ca2+浓度稳态及抗氧化作用等功效[1].近年来，又发现其具有抗炎、镇痛、抗氧化、抗肿瘤及心血管保护等作用[2]，是重要的保护心肌损伤的物质.已证明Tau在Iso致Wistar大鼠MF损伤中显示出抗MF的作用[3- 4].本研究拟在细胞水平上探讨Tau对于MyoFbs增殖的抑制作用，并进一步探讨其作用机制.

1材料与方法

1.1实验动物

Wistar大鼠的乳鼠，1～3日龄，清洁级，雌雄兼用(吉林大学医学部实验动物中心，合格编号：SCXK 2010-0008).

1.2药品与试剂

牛磺酸(中国医药集团上海化学试剂公司)；MTT和AngⅡ(美国Sigma公司)；血清和IMDM(美国Gibco公司)；p-PKCα一抗(即羊抗大鼠的p-PKCα抗体)及ERK1/2一抗(羊抗大鼠的p-ERK1/2抗体)(美国Santa cruz公司)；羟脯氨酸试剂盒(南京建成生物有限工程公司)；胰蛋白酶(宝泰克生物制品科技公司)；二抗(兔抗山羊抗体)(中杉金桥生物有限公司)；S-P试剂检测盒(福州迈新生物技术公司)；碘化丙啶(美国Biotium公司)；DAB显色液(北京博奥森生物技术有限公司).

1.3实验仪器

CO2孵箱(HERAEUS)；超净工作台(AIR TECH)；倒置显微镜(OLYMPUS CK40)；酶标仪(SUNRISE)；低温离心机(SORVALL)；GIS天能凝胶成像系统(上海).

1.4MyoFbs分离及培养

Wistar大鼠的乳鼠(1～3日龄)，无菌条件下开胸取出心脏，凉的D-Hank’s液洗两次，剪切成1 mm3大的碎片，用浓度为0.125%的胰蛋白酶多次消化，收集各次消化的上清液，离心，弃上清，用胎牛血清(浓度10%)的IMDM培养基重悬制成细胞悬液，重新接种在培养瓶中，置于5% CO2、37℃培养箱内培养.实验中采用3～5代的MyoFbs.

1.5实验分组及给药

将MyoFbs细胞分为正常对照组、AngⅡ模型组、Tau组、PKCα抑制剂(D4681 0.625 mg/L)组和ERK1/2的抑制剂(PD98095 25 mmol/L)组.各组MyoFbs无血清培养12 h后，均给予1%浓度血清的IMDM及终浓度为1×10-7mol/L的AngⅡ(除对照组外均给)，药物治疗组给予终浓度分别为30，60，120 mmol/L的Tau.

1.6细胞增殖的测定

将3～5代的MyoFbs制成悬液，以浓度1×105个/mL接种于96孔培养板，每孔200 μL.待长势较好时分别应用上述的各项处理因素作用48 h.每孔加入20 μL的MTT溶液(5 mg/L)，37 ℃孵箱继续培养4 h，结束培养，每孔加DMSO150 μL，震荡10 min，于490 nm波长的酶标仪上检测吸光度(A)值，以A值(给药组)/A值(对照组)× 100%表示MyoFbs的增殖率.

1.7测定Ⅰ，Ⅲ型胶原的含量

采用第3代MyoFbs制成悬液，接种于24孔培养板(浓度2.5×105个/mL，每孔1 mL).按照上述方法处理各实验组，于培养48 h后收集各组上清液，检测Ⅰ，Ⅲ型胶原的量.

1.8免疫细胞化学染色检测p-PKCα膜转位和p-ERK1/2核转位及表达

将第3代MyoFbs放入预先放置了10 mm×10 mm盖玻片的24孔板中，置37 ℃、5% CO2培养箱内培养48 h，各组无血清培育12 h后，各处理因素作用MyoFbs 24 h，取出生长有MyoFbs的小盖玻片，用PBS洗涤3次，每次约5 min，多聚甲醛(浓度4%)固定30 min，自然干后进行细胞化学染色.SP法阳性反应呈现棕黄色颗粒，用PBS代替一抗，其染色为阴性对照.采用Image-Pro Plus5.0V图像分析软件进行各组的p-ERK1/2和p-PKCα在MyoFbs中表达的平均光密度值分析[17].

1.9Western blot检测p-ERK1/2和p-PKCα蛋白的表达

细胞分组及处理同1.6，按文献[5]方法提取MyoFbs膜性组分的PKCα及胞核中的ERK1/2.各取50 μg蛋白，用SDS-PAGE分离.电转移PKCα及ERK1/2蛋白至PVDF膜，用3%胎牛血清白蛋白封闭PVDF膜，置于4 ℃冰箱过夜，再加入p-ERK1/2和p-PKCα抗体；二抗(1∶500的辣根过氧化物酶标记兔抗山羊抗体)，孵育2 h.DAB显色液显色，GIS凝胶成像系统检定蛋白质印迹条带的灰度.

1.10统计学分析

2结果

2.1Tau对MyoFbs增殖的影响

MTT法结果表明：AngⅡ组MyoFbs增殖率明显高于对照组(P<0.001)，经Tau(120，60，30)作用MyoFbs 48 h后，MyoFbs增殖率均降低，与AngⅡ组比较差异具有统计学意义(P<0.01或P<0.05)，且呈量效关系.特异性PKCα抑制剂D4681组和ERK1/2的抑制剂PD98095组细胞增殖率降低，与模型组比较差异具有统计学意义(P<0.05)(见图1).

2.2Tau对胶原含量的影响

各因素作用MyoFbs 48 h后，AngⅡ组MyoFbs分泌的Ⅰ，Ⅲ型胶原含量高于对照组(P<0.01)，Tau(120，60，30)可抑制AngⅡ诱导MyoFbs胶原的合成(P<0.05).特异性PKCα抑制剂D4681组和ERK的抑制剂PD98095组Ⅰ，Ⅲ型胶原的含量降低，与模型组比较差异具有统计学意义(P<0.05).结果见表1.

表1牛磺酸对心肌成纤维细胞分泌胶原含量的影响

Tab.1Effect of Tau on the collagen content of neonatal rats MyoFbs induced by AngⅡ

注：与对照组比较，**：P<0.001；与AngⅡ组比较，▲：P<0.05，△△：P<0.01

2.3Tau对MyoFbs p-PKCα膜转位及表达的影响

各处理因素作用48 h后，免疫细胞化学染色可见对照组细胞中有少量p-PKCα的膜转位和表达，而AngⅡ模型组细胞中p-PKCα的膜转位和表达较多，明显高于对照组(P<0.01).Tau(30，60和120)可不同程度的抑制p-PKCα的膜转位和表达(P<0.05)(见图2).

2.4Tau对MyoFbs p-ERK1/2核转位及表达的影响

各处理因素作用48 h后，免疫细胞化学染色和荧光共聚焦可见模型组细胞胞核明显深染，且数量较多，与对照组比较差异具有统计学意义(P<0.01).Tau(30，60和120)可不同程度地抑制p-ERK1/2的核转位和表达(P<0.05)(见图3).

2.5Tau对MyoFbs的p-PKCα表达的影响

Western blot及凝胶成像检测发现：与正常对照组相比，AngⅡ组的p-PKCα蛋白量增加(P<0.001)；Tau 60，120 mmol/L剂量组、特异性PKCα抑制剂D4681与Tau 60 mmol/L组p-PKCα蛋白的表达量低于AngⅡ组，差异具有统计学意义(P<0.001或P<0.01)，而单纯D4681组p-PKCα蛋白表达量比AngⅡ模型组低，但无统计学意义(P>0.05).以上结果说明Tau与D4681抑制p-PKCα蛋白表达具有协同效应(见图4).

2.6Tau对MyoFbs的p-ERK1/2表达的影响

Western blot及凝胶成像检测发现：与正常对照组相比，AngⅡ组的p-ERK1/2蛋白的表达增加(P<0.01)；Tau 60 mmol/L和120 mmol/L剂量组、Tau 60 mmol/L与PD98095组的p-ERK1/2表达量低于AngⅡ组，差异具有统计学意义(P<0.01).说明Tau通过抑制p-ERK1/2蛋白表达抑制MyoFbs的增殖，且PD98095能加强Tau的抑制作用(见图5).

3讨论

MyoFbs的异常增殖是MF发生的基础，MF主要的病理改变是MyoFbs产生的ECM在心肌中的堆积，造成室壁僵硬，收缩有障碍，因而目前治疗MF的重要靶点是抑制产生ECM的MyoFbs的增殖[6].在诱发MF的诸多因素中，AngⅡ发挥了至关重要的作用[7].本实验拟在细胞水平来观察Tau对AngⅡ诱导MyoFbs增殖、Ⅰ和Ⅲ型胶原、p-PKCα膜转位和表达及p-ERK1/2核转位及表达的影响，进一步探讨Tau对于MyoFbs增殖的抑制作用，并初步揭示其作用机制.

以往研究显示：Tau可抑制AngⅡ诱导的MyoFbs增殖[8-10]，但其具体的作用机制不清楚.本研究在以往工作基础上，进一步探讨Tau抑制MyoFbs增殖及抗MF的作用，探讨其与p-PKCα及p-ERK1/2之间的相互关系，明确其作用机制.为此本实验通过免疫细胞化学染色和Western blot等不同的实验方法来研究.

在心肌细胞PKC各亚型中，PKCα表达量最高[9]，但目前研究较少.一些研究[10-11]表明：心血管疾病发生、发展过程中，PKCα起到正性调控作用.任何一种PKC亚型的活性程度都与它的磷酸化程度、表达水平及细胞内定位有关，磷酸化后将由胞质向胞膜移位.本实验中发现Tau抑制MyoFbs增殖及减少胶原合成时，也抑制p-PKCα的蛋白表达和膜转位.由此可知：AngⅡ促进MyoFbs增殖时，有p-PKCα参与此过程.为进一步揭示PKCα在Tau抑制AngⅡ诱导MyoFbs增殖中的作用机制，实验中选择运用了PKCα特异性的抑断剂D4681对MyoFbs增殖进行干预.实验结果表明：与AngⅡ组相比较，D4681组的MyoFbs增殖率降低、胶原生成量减少；D4681与Tau联合应用可加强此作用；此结果掲示PKCα参与到了AngⅡ诱导的MyoFbs增殖过程，抑制p-PKCα的膜转位及表达就可抑制MyoFbs的增殖，进而逆转MF.

细胞信号调节激酶1/2 是ERK1/2家族重要成员之一，其表达广泛，并且涉及调节细胞多种生物学行为[12-13].诸多刺激因子如细胞因子、生长因子、病毒及细菌等均可致此条信号通路激活，从而诱导细胞分化、增殖、生长、细胞周期变化及凋亡等[14-16].PD98059能特异性地阻断剂ERK1/2信号通路.许多年来，曾有许多学者利用PD98059特异性阻断ERK1/2信号通路的激活，探讨此信号通路在调节细胞生物学功能及行为中的作用.本实验发现Tau抑制MyoFbs增殖及胶原合成时，也抑制了p-ERK1/2的蛋白表达和核转位.应用ERK1/2特异性的阻断剂(PD98059)对MyoFbs进行阻断干预，与AngⅡ组比较胶原含量和细胞增殖率都明显降低.Western blot结果显示：PD98059组p-ERK1/2蛋白表达显著低于AngⅡ组.由此可知：p-ERK1/2参与到了AngⅡ诱导MyoFbs增殖过程，Tau可抑制p-ERK1/2的蛋白表达及核转位，抑制MyoFbs的增殖，进而抑制MF发生.

本实验研究结果：Tau可降低MyoFbs的A值及减少Ⅰ，Ⅲ型胶原的含量，表明Tau可抑制MyoFbs的增殖及MF的发生；同时Tau可减少p-PKCα膜转位及表达、p-ERK1/2核转位及表达.因而说明Tau通过抑制p-PKCα和p-ERK1/2的转位和表达，进而抑制MyoFbs增殖及胶原合成，抑制MF.本研究对Tau通过PKCα和ERK1/2等信号分子抑制AngⅡ诱导的MyoFbs的增殖和MF的机制进行了初步的探讨，但其具体的细胞内信号转导通路还需进一步的研究.

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【责任编辑：陈丽华】

Experimental Study on Effect of Taurine on the Anti-proliferation of Myofibroblasts

Wang Liying1，Su Haiyan2，Li Chunying1，Wu Dianxiu1，Liu Nannan1

(1.BasicMedicalCollegeofBeihuaUniversity，Jilin132013，China；2.JilinTumorHospital，Changchun130021，China)

Abstract：Objective To investigate the effect of Taurine(Tau)on inhibiting the proliferation of myoFbs of the neonatal rats induced by angiotensinⅡ(AngⅡ)，and to explore its mechanism.Methods The myoFbs proliferation of the cultured neonatal rat was induced by AngⅡ，and was detected with thiazole blue(MTT)colorimetric assay.The levels of collagenⅠand collagen Ⅲ were measured by hydroxyproline kit.Translocation and expression of p-PKCα in cells membrane or nuclear were determined by the immunohistochemistry staining with image analysis software.The expression and content of p-PKCα and p-ERK1/2 in cells were determined with western technology and gel imaging system.Results MyoFbs proliferation and hydroxyproline content in the culture medium were markedly inhibited when myoFbs were dealed with Tau at the concentrations of (120，60 and 30)mmol/L for 24 h(P<0.01，P<0.05，respectively)，and showed dose-dependent.Immunocytochemistry，western blot and image analysis system showed that Tau could inhibit the expression and membrane translocation of p-PKCα，and further inhibit the nuclear translocation and expression of p-ERK1/2.These results showed statistically significant difference compared with AngⅡ group(P<0.01).Conclusion These results suggest that Tau can inhibit the proliferation of myoFbs and the increase of collagen content by inhibiting the translocation and expression of p-PKCα in membrane，and then inhibit MF and reverse cardiac remodeling.

Key words：taurine；myofibroblasts；angiotensinⅡ；protein kinase Cα；extracellular signal regulated kinase1/2

中图分类号：R994.6

文献标志码：A

作者简介：王立英(1974-)，女，博士，副教授，主要从事心血管药理学研究，E-mail：ly741023@126.com；通信作者：刘楠楠(1976-)，女，博士，讲师，主要从事免疫病理学研究，E-mail：liunn1976@163.com.

基金项目：国家自然科学基金资助项目(30873066/C180102)；吉林市科技发展计划项目(201536058)；北华大学博士启动基金(199500033).

收稿日期：2015-06-10

文章编号：1009-4822(2016)02-0200-05

DOI：10.11713/j.issn.1009-4822.2016.02.012