局灶性脑缺血再灌注损伤神经细胞凋亡的研究

姜立刚，李　雪，李海平，李　威

(北华大学附属医院，吉林 吉林　132011)



局灶性脑缺血再灌注损伤神经细胞凋亡的研究

姜立刚，李雪，李海平，李威

(北华大学附属医院，吉林 吉林132011)

摘要：目的 研究局灶性脑缺血再灌注损伤后神经细胞凋亡及其大鼠脑组织不同时间病理学改变情况.方法 随机选取66只成年Wistatr大鼠，按照随机数字法分3组，对照组(假手术组，n=6)、观察1组(脑缺血组，n=24)、观察2组(脑缺血再灌注组，n=36).采用线栓法制造大鼠局灶性脑缺血再灌注模型，手术后HE染色，并分别采用TUNEL法和电镜观察大鼠缺血灌注损伤后神经元凋亡情况和细胞凋亡形态的变化.结果 大鼠缺血再灌注后0～63 h时其神经功能损伤最为严重，伴随时间的延长逐渐能得到轻微缓解和改善，再灌注24 h后神经功能明显好转，之后再次出现加重的趋势.研究发现：再灌注后神经元会出现凋亡，TUNEL阳性细胞集中在灌注后病灶中心的边缘区域以及皮层区.结论 线栓法制备动物脑组织缺血灌注模型能有效用于脑组织缺血再灌注后的临床分析，局灶区的神经元以凋亡、坏死为主，其中轻度脑缺血主要以神经凋亡为主，中重度缺血主要以坏死为主.

关键词：再灌注损伤；局灶性脑缺血；神经细胞凋亡；神经功能

【引用格式】姜立刚，李雪，李海平，等.局灶性脑缺血再灌注损伤神经细胞凋亡的研究[J].北华大学学报(自然科学版)，2016，17(2)：205-208.

为探讨局灶性脑缺血再灌注损伤后神经细胞凋亡情况，本研究选用自制局灶性大鼠脑缺血再灌注模型，观察大鼠脑组织不同时间病理学改变和神经功能评分的关系，并分别应用TUNEL法和电镜观察大鼠缺血灌注损伤后神经元凋亡情况和细胞凋亡形态的变化.

1资料与方法

1.1动物资料及分组

选取Wistatr成年健康大鼠66只，均为雄性，体质量252～282 g.随机分为3组，对照组(假手术组，n=6)；观察1组(脑缺血组，n=24)，依据脑缺血时间点不同，缺血后0.5，1，2，4 h各6只；观察2组(脑缺血再灌注组，n=36)，依据再灌注时间点不同，再灌注0.5，3，6，12，24，48 h各6只.

1.2模型制备和手术操作

根据ZeaLonga线栓法制备MCA(大脑中动脉)阻塞模型，改进后制备大鼠局灶性缺血后再灌注模型.采用浓度为10%的水合氯醛腹腔注射麻醉，300 mg/kg，取仰卧位固定，除毛消毒后，选颈部正中作切口，并暴露分离CCA，ICA(颈内动脉)、ECA(颈外动脉)、PPA(翼腭突动脉)，术中尽量避免刺激迷走神经.用血管夹关闭ECA远端和CCA近端，于ECA远端开口，用肝素浸泡单丝尼龙线，浸泡后插入开口处并加热圆钝，避免对血管内膜造成损伤.模型栓线经ICA进入颅部，插入约18～21 mm，遇阻后退出0.5 mm，至前动脉近端，完全阻断中动脉大脑血供.去除血管夹恢复血供，并固定栓线.根据实验要求抽出栓线，观察不同时间点的缺血情况，制造出再灌注模型.术中室温25 ℃左右，对照组操作同上，但栓线不插入.

1.3模型成功判定

手术顺利，操作无误；大鼠清醒后左侧表现出Hprner征，右侧上肢表现偏瘫则显示为手术成功[1-2].

1.4神经功能评分

根据2001年Harrison六级神经功能评分标准进行评估[3-5]：未出现神经功能异常为0分;大鼠右前抓无法完全伸直为1分;被推时大鼠抵抗力减少或右抓无法完全抓紧为2分;自发行走或转圈时偏向一侧为3分;仅受刺激时行走为4分;意识下降、无法自发行走为5分;意识丧失、出血量过多、术后1 h呼吸困难、无神经损伤症状者均需补充目标大鼠.

1.5标本制备

1)HE染色标本：根据实验分组要求在相应时间点灌注后注射浓度为10%的水合氯醛进行麻醉处理，暴露心脏，快速灌洗，再用浓度为4%的多聚甲醛PBS缓冲液灌注约30 min，切开脑组织，选取位于视交叉区域0.5 mm左右处组织，在固定液中保存24 h，制切片，切片厚度约为5 μm，并保存在4 ℃冷库中备用.2)电镜检测所需标本制备：选取缺血侧大鼠海马区组织1 mm×1 mm切块，用戊二醛(2.5%)固定后，给予脱水包埋处理，最后应用电镜进行观察分析.3)TUNEL法：使用TUNEL检测试剂盒进行检测，严格按照其检测步骤操作，其中的黄色颗粒判定为阳性.

1.6统计学处理

2结果

2.1神经功能缺损表现

左侧缺血神经损伤表现：临床主要症状是右上肢出现偏瘫，同侧出现Hprner征(+).大鼠右前抓无法完全伸直，右抓无法完全抓紧，自行运动时偏向于右侧，严重者行走能力和意识丧失.再灌注发生6 h内大鼠神经损伤最为严重，伴随时间的延长逐渐得到轻微缓解和改善，再灌注24 h后神经功能明显好转，之后再次出现加重的趋势.由表1可知：各组间神经功能缺损情况通过秩和检验差异无统计学意义(P>0.05)，说明再灌注后不同时间点的神经功能评分差异不明显.

表1　大鼠局灶性缺血再灌注后神经功能缺损评分

2.2病理学改变

2.2.1肉眼下观察

对照组脑组织无明显变化，色泽形态正常；观察1组、2组脑组织表现为苍白肿胀.

2.2.2HE染色镜下观察

对照组脑组织胶质细胞、神经元及其组织毛细血管等形态结构均无明显变化，细胞核结构完整、清晰可见.在局灶性缺血周围区域可见细胞质、细胞核染色较深，褶皱收缩，呈三角形，且细胞中染色细胞质具有强烈嗜酸性.而在局灶中心区域，胞膜破裂，细胞核褶皱收缩，核膜分散碎裂，且细胞中染色细胞质表现为轻度嗜酸性，有部分局灶区域，细胞结构直接消失，呈质化改变.脑组织缺血灌注后缺血侧部分区域神经细胞核结构不清楚，染色颜色较淡，且细胞核数量较少，灶性细胞出现坏死(如溶解、肿胀等)特征，与缺血中心区域表现相似.纹状体内侧区域及其脑组织额叶皮层区域细胞体积明显减小，而染色质则边缘聚集、收缩，同时细胞核也固缩，与缺血外周区相似.再灌注后早期缺血中心区域染色较淡，神经元轻度皱缩，细胞核、细胞质清晰可辨.再灌注24 h后，缺血中心区域神经元坏死凝固，细胞核、细胞质结构不清，细胞质呈嗜酸性改变，染色颜色较深，细胞排列错乱，正常区与缺血区分界明显，染色颜色较淡，白质较为疏松，且伴有空泡.再灌注48 h后，缺血中心区域灶性细胞坏死凝固，伴有大量空泡形成，白质变得更加疏松.

2.2.3透射电镜下观察

再灌注后神经元主要表现为凋亡体征，在电镜下显示神经元染色质在灶区边缘集中，在细胞核内凝聚的染色质形成质环，呈现不规则形状.质环内均匀分布细小颗粒状物以及低电子密度的核质，伴有透明空泡，胞质收缩，而细胞质中的线粒体结构形态则无明显变化.

2.2.4TUNEL法检测结果

TUNEL法检测细胞核呈棕黄色，表现为阳性，对照组的脑组织仅有很少一部分细胞凋亡，而观察1组脑组织中心以及周围区域均分布有凋亡细胞.TUNEL法检测再灌注后6 h阳性细胞才开始分散，出现在局灶中心区域，12 h后集中出现在中心区的边缘部分，呈簇状，中心部分较少呈分散状分布；而24 h后在坏死病灶的皮层和周边区域阳性细胞大量出现.而半暗带区细胞出现死亡的形式集中以凋亡为主.大鼠脑再灌注后不同时间段的TUNEL检测结果见表2.由表2可知：再灌注后3 h凋亡指数略高于对照组，但组间比较差异无统计学意义(P>0.05)；再灌注后6 h凋亡指数显著高于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)；且随着灌注后时间的推移，凋亡指数不断升高，差异不断增加，TUNEL检测阳性率明显升高，缺血再灌注后48 h凋亡指数明显高于其他时间段指数情况，差异具有统计学意义(P<0.05).

表2　　　　大鼠脑缺血1 h再灌注不同时间段TUNEL检

注：与对照组相比，*：P<0.05；与再灌注48 h后相比，#：P<0.05

3讨论

目前，制备局灶性脑血动物模型比较成熟的方法有自体血凝块注入、MCA等，两种方法各有优缺点，能满足不同的实验要求[6-7].采用线栓法阻断血供建立动物缺血再灌注模型具有术中创伤小、存活时间较长、手术时长较短、缺血位置恒定且无需开颅手术等优点，能准确按照实验要求控制灌注、缺血的时间点，因此被广泛应用于动物模型实验中[8-10].

本研究中我们采用拴线法制备的动物缺血再灌注模型，其梗死临床表现与人类梗死接近，具有研究意义[11-13].通过分组研究可知：大鼠缺血再灌注后0～6 h时神经功能缺损情况最为严重，随着时间的推移逐渐缓解改善，24 h后明显好转，随后再次加重.说明缺血再灌注可能会引发继发性脑损伤.在电镜下观察发现，再灌注后神经元会表现为凋亡，TUNEL阳性细胞集中在灌注后病灶中心的边缘区域以及皮层区.在动物模型研究[14-15]中指出：局灶区部分神经元死亡，组织学表现为染色质分裂破碎或固聚，DNA裂解，膜结构完整，且显示为阳性.在缺血早期，轻度损伤半暗带区检出细胞凋亡，证实了局灶区神经元以凋亡、坏死为主，而轻度缺血以凋亡为主，神经元凋亡后仍具有组织学体征，但部分组织被破坏或出现空泡、肿胀.

通过TUNEL检测显示：再灌注后6 h凋亡指数显著高于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)；且随着灌注后时间的推移，凋亡指数不断升高，差异不断增加.TUNEL法检测阳性率明显升高，提示局灶性脑缺血再灌注能有效抑制神经元凋亡.

综上所述，线栓法制备动物脑组织缺血灌注模型能有效用于脑组织缺血再灌注后的临床分析，局灶区神经元以凋亡、坏死为主，其中轻度脑缺血主要以神经凋亡为主，中重度缺血主要以坏死为主.

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【责任编辑：陈丽华】

Research on the Nerve Cell Apoptosis Induced byReperfusion in Rats with Focal Cerebral Ischemia

Jiang Ligang，Li Xue，Li Haiping，Li Wei

(AffiliatedHospitalofBeihuaUniversity，Jilin132011，China)

Abstract：Objective To research the nerve cell apoptosis induced by reperfusion injury in rats with focal cerebral ischemia and the pathological alteration of the brain tissue at different times in rats.Methods The selected 66 adult Wistar rats were randomly divided into three groups，the control group(sham-operation group，n=6),the observation group 1(cerebral ischemia group，n=24)，and the observation group 2(cerebral ischemia reperfusion group，n=36).The model rats with focal cerebral ischemia reperfusion were established by suture method.After operation and HE staining，the condition of neuritis apoptosis and the morphological changes of apoptosis were determined by TUNEL method and electron microscope.Results The most serious nerve function deficit appeared during 0～63 h after ischemia reperfusion in rats，which would slightly relived and improved along with the passage of time.The neurological function improved markedly after 24 h reperfusion，and then appeared the tendency of exacerbation.The research showed that nerve cells would appear apoptosis after reperfusion，the TUNEL positive cells were concentrated at the marginal area and tegument region after reperfusion.Conclusion The model rats established by suture method are effective for the clinical analysis on cerebral ischemia reperfusion.The major death ways of the nerve cells in focus are apoptosis and necrosis，the primary cause of mild cerebral ischemia is nerve apoptosis，and the primary cause of moderately severe cerebral ischemia is necrosis.

Key words：reperfusion injury；focal cerebral ischemia；nerve cell apoptosis；neurological function

中图分类号：R743.3

文献标志码：A

作者简介：姜立刚(1978-)，男，博士，副教授，副主任医师，硕士生导师，主要从事脑血管病临床研究，E-mail：beihua78726@163.com；通信作者：李威(1959-)，女，博士，教授，主任医师，硕士生导师，主要从事神经内科学研究，E-mail：liwei1535@sina.com.

基金项目：吉林省教育厅科学技术研究项目(2013441)；吉林省卫生厅基金项目(2012Z102).

收稿日期：2015-10-23

文章编号：1009-4822(2016)02-0205-04

DOI：10.11713/j.issn.1009-4822.2016.02.013