钩吻素子在小鼠体内的组织分布研究

张永志，何洪源，佘彩蒙(中国人民公安大学　刑事科学技术学院，北京　100038）



钩吻素子在小鼠体内的组织分布研究

张永志，何洪源，佘彩蒙
(中国人民公安大学刑事科学技术学院，北京100038）

摘要：建立小鼠染毒动物模型，通过尾静脉给药确定钩吻素子的半数致死量，采用超高效液相色谱串联质谱技术对小鼠不同组织脏器进行定量分析，确定钩吻素子主要分布器官。根据预实验结果，确定给药浓度为20.48 mg/kg、25.6 mg/kg、32 mg/kg、40 mg/kg、50 mg/kg，记录小鼠在给药0.5 h内的死亡时间及数量，解剖小鼠并对组织脏器进行检测。钩吻素子对小鼠的半数致死量为30.60 mg/kg，95%可信区间为28.10～33.32 mg/kg，由钩吻素子引起急性中毒死亡后，心脏、肺、肾等脏器是毒素分布的主要器官。实验确定了钩吻素子对小鼠的半数致死量，并对相关脏器以及血液进行定量检测，为有关钩吻素子的毒理研究提供参考，为相关中毒案（事）件中检材的选择以及钩吻素子的检测提供科学依据。

关键词：钩吻；钩吻素子；超高效液相色谱串联质谱；组织分布

何洪源（1965-），女，北京人，中国人民公安大学刑事科学技术学院副教授，博士；

佘彩蒙（1990-），男，北京人，中国人民公安大学刑事科学技术学院硕士研究生。

钩吻(Gelsemium elegans Benth)作为一种常见的中草药，主要分布在我国南方，其药用价值很高，多为外用，忌内服，可用于消肿止痛﹑祛风散热。[1]钩吻素子(Koumine)属生物碱类，是钩吻的主要成分，[2]可用于多种疾病的治疗，甚至会成为治疗肿瘤和银屑病的一种新型药物。[3][4][5]钩吻素子毒性较大，近些年，随着钩吻药物的开发与应用逐渐深入，相关的中毒案件也在不断地增加。[6][7]实验首先针对钩吻素子的半数致死量进行研究，再将实验采集的生物检材，利用超高效液相色谱串联质谱(UPLC-MS/MS)进行定量分析，[8]确定钩吻素子在小鼠体内组织脏器的分布情况，为相关中毒案（事）件中检材的选择以及钩吻素子的检测提供科学依据。

一、材料

（一）药品与试剂

钩吻素子（购于广西立安生物有限公司，纯度：98%）；乙腈﹑甲酸﹑甲酸铵（美国Fisher Scientific) ；酒精﹑生理盐水（南京四通化学用品公司）。

（二）仪器

超高效液相色谱串联质谱仪（ACQUITY UPLC-XEVO TQ MS,美国Waters公司）；旋涡混合器（BM-2，上海德利科技有限公司）；自动匀浆机（D-15，德国ART MICCRA）；高速离心机（SLCZ-200，江苏宏达仪器有限公司）；高速振荡器（QW-650，北京超越科技有限公司）；电子分析天平（PCY1000，上海科特器材有限公司）；ACQUITY UPLC BEH C18（ 2.1×50 mm, 1.7 μm）色谱柱（美国Waters公司）。

（三）动物

实验选用周龄为9周左右的ICR雄性小鼠，共50只，小鼠购于北京斯贝福动物有限公司，体重：（40±2）g，卫生级别：VAF/SPF；许可证编号：SCXK（京）2012-0005；合格证编号：0297638。实验前将小鼠在鼠房适应性喂养3天，保证饲养环境适宜，鼠具干净卫生，实验前禁食12 小时，不禁水。本研究的动物实验标准符合机构责任委员会的伦理（道德）标准，可以进行研究所需的动物实验。

（四）标准溶液的配制

取10 mg钩吻素子，用10 mL乙腈溶解，得到1 mg/mL 的储备液，将其依次稀释得到10 ng/mL﹑50 ng/mL﹑100 ng/mL﹑200 ng/mL﹑500 ng/mL﹑1000 ng/mL的标准品溶液，用0.22 μm的有机滤膜过滤。

二、方法

（一）仪器条件

1.色谱条件

色谱柱采用ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×50 mm﹑1.7 μm）；流动相：A:乙腈，B:甲酸铵（5 mM）- 0.1%甲酸的水溶液；柱温：35 ℃；进样量：10 μL；流速：0.5 mL/min；进样时间：5 min；洗脱程序：0～3 min：流动相A:B 为10:90，3～4 min：流动相A:B为70:30，4～5 min：流动相A:B为10:90。

2.质谱条件

离子源：电喷雾电离（ESI）；检测方式：正离子；毛细管电压：3.2 kV；离子源温度：150 ℃；脱溶剂气流速：800 L/h；脱溶剂气温度：400 ℃；锥孔气流量：50 L/hr；扫描模式：多反应离子监测（MRM）模式；锥孔电压：48 V。稳定基峰离子为m/z 307.39，两个子离子碎片分别是m/z 180.35和m/z 167.30，通过比较两者丰度高低，最后选择丰度高的前者作为定量离子。100 ng/mL钩吻素子标准溶液MRM离子色谱图如图1所示。

（二）给药与样品采集

溶剂选用酒精和生理盐水（V:V=2:1），前期预实验结果表明：小鼠经尾静脉注射钩吻素子后，Dn=20 mg/kg，Dm=50 mg/kg。依据上述结果，经改良寇氏法计算得出实验剂量分别为20.48 mg/kg﹑25.6 mg/kg﹑32 mg/kg﹑40 mg/kg﹑50 mg/kg，给药后观察实验小鼠在0.5 小时内的中毒表现以及死亡时间﹑数量，之后采集小鼠组织并冷冻保存，用于后期检测。

图1　Chromatograms of Koumine with MRM at a level of 100 ng/mL

（三）样品处理与检测方法

取上述实验过程中所得检材（血液：100 μL，脏器：50 mg并匀浆处理），加入乙腈4 mL，涡旋1 min，先以2000 r/min振荡15 min，再以8000 r/min离心30 min，最后吸取上层清液并经0.22 μm的有机滤膜过滤，进样检测，检测条件参照“仪器条件”项，以外标曲线法定量。

三、结果

（一）工作曲线

取小鼠空白血100 μL﹑空白肝50 mg，分别添加浓度为10 ng/mL﹑50 ng/mL﹑100 ng/mL﹑200 ng/mL﹑500 ng/mL﹑1000 ng/mL的钩吻素子标准液，加入4 mL乙腈，前处理方法参照“样品处理与检测方法”项，检测条件参照“仪器条件”项，得到回归方程，血：y=109.62x+1198.6，R2=0.9994；肝：y=563.70x+1437.1，R2=0.9993。结果表明在浓度为10～1000 ng/mL的范围内，钩吻素子线性关系良好，且最低检测限为0.08 ng/mL和0.12 ng/mL （S/N≥3），最小定量限为0.2 ng/mL和0.4 ng/mL（S/N≥10）。

（二）回收率和精密度

取小鼠空白血100 μL﹑空白肝50 mg，分别添加浓度为10﹑100﹑500 ng/mL的钩吻素子标准液，前处理方法参照“样品处理与检测方法”项，检测条件参照“仪器条件”项，得到日内﹑日间精密度。见表1。

表1　Recovery and within- and between-day precisions of Koumine in plasma and liver samples（n=5）

（三）死亡情况和半数致死量

第1组实验小鼠在给药后立即表现出中毒症状，小鼠精神萎靡，困倦嗜睡，活动减少，身体发抖，四肢不稳，呼吸变缓，之后其症状减轻，无小鼠死亡。实验2～4组小鼠前期的中毒症状与第1组基本相同，但初期中毒症状持续时间变短，之后小鼠出现异常兴奋，具体表现为呼吸急促，四肢僵直，全身抽搐，甚至部分小鼠出现痉挛症状并最终死亡。第5组小鼠由于给药剂量大，没有表现出前期的中毒症状，给药后小鼠呼吸受到明显抑制，全身僵直并伴有剧烈的抽搐现象，部分小鼠还会出现跳跃和强直性惊厥症状，实验小鼠在很短时间内全部死亡。5组实验小鼠的给药剂量及死亡情况见表2。

表2　 Dose of Koumine and death rate of mice in the five groups

根据上述表格中的相关数据以及改良寇氏的计算方法，半数致死量为30.60 mg/kg，95%可信区间是28.10～33.32 mg/kg。

（四）组织含量分布

实验小鼠检材的前处理方法参照“样品处理与检测方法”项，检测条件参照“仪器条件”项，通过对50只小鼠的脏器及血液进行检测分析，得到钩吻素子在实验小鼠各脏器及血液中的含量分布。采用SPSS统计软件处理所得数据，平行3次进样，实验结果以平均数﹑标准差进行统计描述。钩吻素子在小鼠不同脏器及血液中的分布结果见表3。

四、讨论

（一）染毒动物模型

本实验选用群体动物模型，选择ICR小鼠作为实验对象，其优点在于稳定性好，简单易复制，能够通过大量实验来保证数据的准确性。[9]实验结果证明，动物模型的建立与实际情况相符，可以用于半数致死量的测定以及毒素的定性定量分析。对于溶剂的选择，实验考察了生理盐水﹑酒精以及两种溶液的混合，由于钩吻素子自身理化性质的限制，生理盐水无法将其溶解，而酒精虽能将钩吻素子溶解，但易引起实验小鼠的酒精中毒，会对实验造成影响，因此实验后期主要考察了酒精与生理盐水体积比例为1:1 和2:1的两种情况。实验发现，由于小鼠注射体积的限制，对于高剂量的钩吻素子，1:1的混合溶液无法完全溶解，而体积比为2:1时，能够实现完全溶解，达到实验要求，因此选择酒精与生理盐水体积比为2:1作为实验的溶剂。

（二）组织含量分布

表3　Distribution of Koumine (μg/g) after a intravenous administration of Koumine model of mice (x=s,　n=10)

钩吻素子毒性很强，[10]静脉注射25.6 mg/kg的钩吻素子时，小鼠便出现中毒症状，甚至部分小鼠死亡。延髓呼吸中枢是钩吻素子的主要作用区域，能够引起呼吸麻痹，导致呼吸衰竭，这是钩吻素子中毒引起死亡的根本原因。[11][12]钩吻素子能够对消化系统造成一定程度的损害，[13][14]对胃﹑肾和肝等脏器作病理观察时可发现大量瘀血，脏器粘膜出现充血﹑肿胀。此外钩吻素子通过作用迷走神经，引起心律失常，进而对心脏造成损伤。[15]实验过程中部分小鼠会出现强直性惊厥甚至跳跃现象，这是由于钩吻素子有类似于γ-氨基丁酸(GABA)拮抗剂的作用。[16]

实验结果显示：钩吻素子广泛分布于小鼠体内的各脏器中。钩吻素子的含量以心脏﹑肺和肾最高，血中含量相对较低，肝﹑胰腺﹑肌肉和膀胱的含量居于中等，胃﹑脾和睾丸含量最低。实验中可以发现，随着钩吻素子给药量的增加，小鼠中毒症状愈加明显且死亡时间缩短。由于小鼠急性死亡，钩吻素子在小鼠体内无法代谢完全，导致2～5组小鼠体内毒素在心脏﹑肾﹑和肺等组织中的含量最高，而第1组小鼠由于给药剂量不足以致其急性死亡，钩吻素子在小鼠体内得以充分扩散和代谢，导致之前毒素含量较低的脏器（如脾﹑胰腺﹑膀胱﹑睾丸等）反而高于其它脏器（如心脏﹑肺﹑肾等）。这一实验结果说明钩吻素子有从血液丰富的脏器(心脏﹑肺﹑肾)向血液不丰富的脏器(脾﹑胰腺﹑膀胱﹑睾丸等)分布扩散的趋势。

实验首先建立染毒动物模型，确定了钩吻素子对小鼠的半数致死量，并通过对生物检材中钩吻素子的定量分析，选取了毒素含量较高的心脏﹑肺﹑肾等脏器作为钩吻素子急性中毒死亡的靶器官，有利于进一步研究钩吻素子的毒理作用，为相关中毒案（事）件中检材的选择以及钩吻素子的检测提供科学依据。

参考文献：

[1]陈翼胜, 中国有毒植物[M]. 北京: 科学出版社, 1990, 371-376.

[2]张兰兰, 王志睿, 黄昌全, 等. 钩吻总生物碱中钩吻素子的提取与分离[J]. 第一军医大学学报, 2004(9): 1006-1008.

[3]Xu Y, Qiu H Q, Liu H, et al. Effects of koumine, an alkaloid of Gelsemium elegans Benth. on inflammatory and neuropathic pain models and possible mechanism with allopregnanolone[J]. Pharmacol Biochem Behav, 2012, 101(3): 504-514.

[4]Liu M, Huang H H, Yang J, et al. The active alkaloid of Gelsemium elegans Benth. are potent anxiolytics[J].Psychopharmacology(Berl), 2013, 225(4): 839-851.

[5]Dutt V, Thakur S, Dhar V J, et al. The genus gelsemium: an update[J]. Pharmacogn Rev, 2010, 4(8): 185-194.

[6]陈仕生，陈业荷，徐志权.钩吻中毒的临床特点及救治探讨[J]. 中国急救医学, 2006(4): 298-300.

[7]孟东江, 罗友杰. 抢救8例钩吻中毒的经验及教训[J].中国社区医师（医学专业）, 2012(313): 314-315.

[8]陈滋浚. 生物检材中雷公藤和钩吻中主要有毒成分的超高效液相色谱串联质谱检验方法研究[D]. 北京: 中国人民公安大学, 2015.

[9]赵森，张云峰，王炯，等.甲哌啶在大鼠体内的分布研究[J]. 中国药科大学学报，2013(2):147-150.

[10]终晓乐,甄汉深,秦海龙,等.钩吻的研究概况[J].中药研究进展,2007(4):16-18.

[11]谢立璟, 韩雪峰. 钩吻中毒的机制、临床特点及处理[J]. 药物不良反应杂志，2006(3):202-204.

[12]苏薇薇,徐伟,梁仁,等.钩吻中毒机理及抢救方法研究[J].中药材, 2001(7):510.

[13]黄仲林, 黎秀叶. 钩吻水溶性总碱对大鼠内脏器官的影响[J]. 中国药理通讯, 1986(3): 18-19.

[14]赵振金, 周其锦, 高英立. 大鼠钩吻碱毒性试验-病理形态学观察[J]. 实验动物与动物实验, 1990(1): 20-21.

[15]杨仓良. 毒药本草[M]. 北京:中国中医药出版社, 1993:1049-1050.

[16]Rujjanawate C , Kanjanapothi D, Panthong A.Pharmacological effect and toxicity of alkaloids from Gelsemium elegans Benth[J]. J Ethnopharmacol, 2003, 89(1): 91-95.

责任编辑：王燕

The Research on Tissues Distribution of Koumine in Mice

ZHANG Yong-zhi, HE Hong-yuan, SHE Cai-meng
(School of Criminal Science and Technology, People's Public Security University of China, Beijing 100038, China)

Abstract:Objective: A poisoned mice model of koumine was established to research median lethal dose (LD50).A UPLC-MS/MS method was used for qualitative detection and quantitative determination of the distribution of koumine in the bio-samples.Methods: Based on the preliminary experimental results, koumine standards were given to mice intravenously with the concentration of 20.48 mg/kg, 25.6 mg/kg, 32 mg/kg, 40 mg/kg, and 50 mg/kg.The mice were observed for 0.5 hour, toxic symptoms and death time were recorded and inspection of tissues and visceral organs were conducted after dissection.Results: The LD50 of mice is 30.60 mg/kg and 95% confidence interval is 28.10～33.32 mg/kg with the injection of koumine intravenously.Visceral organs with higher toxin distribution than others such as heart, lungs, kidney can be considered as target organ of koumine poisoning.Conclusion: In this research, LD50 and 95% confidence interval has been established and target organs in acute poisoning of koumine in mice has been selected, which can provide target samples and the basis for evaluation for the investigation of the poisoning cases involved in koumine in forensic science field.

Key words:Gelsmium elegans Benth; koumine; UPLC-MS/MS; tissue distribution

DOI:10.13310/j.cnki.gzjy.2016.02.007

[中图分类号：D918.9

文献标识码：A

文章编号：1671-5195（2016）02-0046-05]

作者简介：张永志（1989-），男，河北任丘人，中国人民公安大学刑事科学技术学院硕士研究生；

基金项目：国家自然科学基金资助项目（81273346）。

收稿日期：2015-10-18