粒毛盘菌黑色素分子修饰及其抗氧化活性

李　兰,　袁怀波,　李盛兰,　叶　明

(合肥工业大学 生物与食品工程学院，安徽 合肥　230009)



粒毛盘菌黑色素分子修饰及其抗氧化活性

李兰,袁怀波,李盛兰,叶明

(合肥工业大学 生物与食品工程学院，安徽 合肥230009)

摘要:文章对一株粒毛盘菌均一性胞内黑色素(LIM205)分别进行羧甲基化、硫酸酯化修饰,制备黑色素衍生物CLIM205和SLIM205,通过紫外光谱和红外光谱初步判断修饰成功;在30 ℃下,LIM205不溶于水,经羧甲基化和硫酸酯化修饰后,成为水溶性黑色素衍生物,CLIM205、SLIM205在水中的溶解度分别为3.75、2.06 g;分别测定LIM205、CLIM205、SLIM205对OH·、O2-·、DPPH·的清除率及Fe(2+)的螯合率,评价LIM205、CLIM205、SLIM205的体外抗氧化活性。相同质量浓度时,CLIM205、SLIM205的抗氧化活性均比LIM205的强,且CLIM205的抗氧化活性比SLIM205的强。因此,CLIM205和SLIM205有望作为一种新型的抗氧化剂应用于食品和药品领域。

关键词:粒毛盘菌黑色素;水溶性;羧甲基化;硫酸酯化;抗氧化活性

0引言

黑色素是一类酚类或吲哚类生物分子[1],来源于一些动植物及微生物[2-4],具有抗氧化、抗辐射、肝损伤保护、免疫和螯合重金属等生物活性[5-9]。黑色素一般不溶于水及常见有机溶剂[10],这一性质限制了其在食品、医药和化妆品等领域的应用,因此提高黑色素的水溶性具有重要意义。目前,提高非水溶性生物活性物质的化学方法主要有氨基酸修饰、硫酸酯化修饰和羧甲基化修饰[11-14]等。

粒毛盘菌属为一类腐生性真菌,深层发酵后可产生大量具有抑菌和抗辐射等活性的黑色素[15-17],其均不溶于水及常见的有机溶剂。采用精氨酸对粒毛盘菌黑色素进行修饰后,获得了水溶性精氨酸黑色素,且修饰后其抗氧化活性增强[14]。目前,国内外对粒毛盘菌黑色素进行其他化学修饰的相关报道并不多。

前期本课题组已获得粒毛盘菌YM205胞内均一性黑色素(LIM205),并解析了其结构。本文分别对LIM205进行羧甲基化和硫酸酯化修饰,探索修饰后的水溶性,并评价其修饰前后的抗氧化活性。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1供试菌株

粒毛盘菌YM205,合肥工业大学微生物资源与应用研究室分离保藏。

1.1.2发酵培养基

酪氨酸 1.0 mmol/L、铜离子 1.1 mmol/L、蔗糖25.5 g/L、酵母膏5.0 g/L、蛋白胨5.0 g/L,pH值为8.0,培养温度为27 ℃,搅拌转速为180 r/min,发酵时间为12 d。

1.2粒毛盘菌胞内黑色素的制备及纯化

将粒毛盘菌YM205种子液接种于100 L机械搅拌发酵罐中发酵,参照文献[17]的方法提取、纯化粒毛盘菌YM205胞内黑色素,冷冻干燥后收集该黑色素备用。采用葡聚糖凝胶G-15进行分级分离,获得主要组分LIM205。

1.3LIM205衍生物的制备

1.3.1LIM205羧甲基化修饰

将300 mg LIM205溶于5 mL NaOH(2 mol/L)、12 mL异丙醇的混合溶液,冰浴中搅拌3 h,搅拌状态下缓慢加入3 g氯乙酸、5 mL NaOH(2 mol/L)、12 mL异丙醇,室温下反应3 h,60 ℃继续反应2 h,溶液冷却至室温,加入冰醋酸调节pH值至中性,于截留分子量为200 Da的透析袋透析48 h,冷冻干燥后获得黑色素衍生物CLIM205。

1.3.2LIM205硫酸酯化修饰

将90 mL吡啶加入附有冷凝管、温度计的250 mL三颈瓶中,用电磁加热搅拌器搅拌,同时缓慢加入三氧化硫-吡啶2.0～3.0 g。加热至90 ℃,再加入LIM205粉末0.5 g,恒温搅拌1 h,冷却至室温。反应液用3 mol/L的NaOH溶液调至中性,静置24 h。自来水和蒸馏水分别透析2 d,过滤,冷冻干燥,得硫酸酯化黑色素SLIM205。

1.4LIM205及其衍生物紫外光谱检测

参照文献[14]的分析方法测定 LIM205、CLIM205、SLIM205的最大吸收波长(λmax),200 ～ 400 nm进行全波段扫描。

1.5LIM205及其衍生物红外光谱

采用FT-IR5700傅里叶变换红外光谱分别对LIM205、CLIM205、SLIM205进行红外光谱分析[18],扫描区间为4 000 ～ 400 cm-1。

1.6LIM205及其衍生物水溶性测定

精确量取10 mL蒸馏水于干燥的烧杯中,加入一定量LIM205,恒温(30 ℃)搅拌,1 h后仍有部分沉淀,静置一段时间后,3 500 r/min离心10 min,取上层溶液,真空冷冻干燥后称质量、计算溶解度,实验重复3次。相同方法分别测定CLIM205、SLIM205的溶解度。

1.7LIM205及其衍生物抗氧化活性

1.7.1对Fe2+的螯合作用

参考文献[14]方法并略作修改。1 mL不同质量浓度的氨基酸-黑色素溶液与0.05 mL FeCl2 (2 mmol/L)混匀后加入0.2 mL Ferrozine溶液(5 mmol/L),静置20 min后于562 nm测吸光度A。蒸馏水代替样品溶液作为空白对照,LIM205、EDTA-2Na作为阳性对照。Fe(2+)螯合率的计算公式为： [14]的方法并略作修改。取1 mL不同质量浓度(0、50、100、150、200、250、300 mg/L)的黑色素LIM205、CLIM205、SLIM205溶液加入5 mmol/L邻二氮菲1.5 mL、pH值为7.4、0.05 mol/L的磷酸缓冲液2.0 mL、7.5 mmol/L FeSO4溶液1.0 mL,每加一管立即混匀,再加入1 mL H2O2(0.1 %),最后以蒸馏水定容至10 mL。反应液37 ℃保温l h,在536 nm测A(损伤)。未损伤管不加H2O2及黑色素溶液或Vc溶液,测A(未损伤)。·OH清除率计算公式为:

Fe2+螯合率=[(A空白-A样品)/A空白]×100%。

1.7.2对·OH的清除作用

1.7.3对O2-·的清除作用

1 mL不同质量浓度(0、50、100、150、200、250、300 mg/L)的LIM205、CLIM205、SLIM205溶液与3 mL pH值为8.2的Tirs-HCl缓冲液混匀,室温下静置25 min,加入0.3 mL邻苯三酚溶液(7 mmol/L),摇匀反应4 min,再加入1 mL HCl (10 mmol/L)终止反应,稀释,在318 nm下测定混合液的吸光度A1,测定蒸馏水代替反应试剂的吸光度 (A1′) 及蒸馏水代替样品溶液作为空白对照的吸光度(A0),LIM205作为对照,O2-·清除率的计算公式为：

O2-·清除率=[1-(A1-A1′)/A0]×100%。

1.7.4对DPPH·的清除作用

参照文献[19]方法略修改。1 mL DPPH·无水乙醇溶液(0.1 mmol/L)分别与3 mL不同质量浓度(0、50、100、150、200、250、300 mg/L)的LIM205、CLIM205、SLIM205溶液混匀,置于黑暗环境下30 min,稀释后在517 nm下测定混合液的吸光度(A1),测定无水乙醇溶液作为空白对照的吸光度(A0),LIM、二丁基羟基甲苯(BHT)作为对照,则DPPH·清除率的计算公式为：

DPPH·清除率=[(A0-A1)/A0]×100%。

1.8数据统计分析

采用SPSS 18统计软件对实验数据进行分析,结果用x±s表示,组间比较用t检验,P< 0.05表示组间存在显著性差异,P< 0.01表示组间差异极显著。

2结果

2.1LIM205制备及其水溶解性

粒毛盘菌YM205胞内黑色素的得率为6.32 g/100 g。经葡聚糖G-15凝胶柱洗脱后,获得3个洗脱组分,收集主要组分LIM205,如图1所示,占均一性组分总质量分数的66.5%。

图1　LIM205的Sephades G-15柱层析图谱

2.2LIM205及其衍生物紫外全波段扫描光谱

LIM205及其衍生物紫外全波段扫描光谱如图2所示。从图2可看出,LIM205在196 nm处具有最大吸收峰，与LEM404-a 的最大吸收波长(210 nm)相近[16];黑色素溶液光密度对数值与波长的线性曲线斜率为-0.001 5～-0.003 0,符合典型黑色素特征[20],在280、260 nm都未见吸收峰,表明其不含蛋白质、脂质等杂质[21]。与LIM205相比,CLIM205的紫外最大吸收峰由于羧甲基的引入产生明显的偏移,SLIM205的紫外最大吸收峰变化较小,但在256 nm附近出现了一个新的宽吸收峰,这可能是引入硫酸基团导致的[22]。

图2　LIM205及其衍生物紫外全波段扫描光谱图

2.3LIM205及其衍生物的溶解度

在30 ℃下,LIM205几乎不溶于水,溶于碱性溶液,CLIM205、SLIM205在蒸馏水中溶解度分别为3.75、2.06 g。该实验结果表明LIM205经羧甲基化修饰后,其水溶性显著增加(P< 0.01)。

2.4LIM205及其衍生物的红外光谱分析

LIM205及其衍生物的红外光谱分析如图3所示。

图3　LIM205及其衍生物红外光谱图

LIM205红外光谱具有典型的黑色素特征吸收峰[23]3 280、1 630 cm-1。3 280 cm-1附近出现强且宽的共振吸收峰，是由O—H或吲哚的N—H伸缩振动产生;在1 630 cm-1处由—COOH的伸缩振动引起;1 540 cm-1处具有环噻嗪振动吸收峰,为棕黑色素的特征吸收峰;1 240 cm-1是酚的O—H弯曲振动[24];700～600 cm-1处的吸收峰由C—S伸缩振动引起[5]。与LIM205的红外光谱相比,1 630 cm-1处羧基吸收峰明显增强,在1 370 cm-1处具有与羧基相连的亚甲基的特征吸收峰,表明LIM205羧甲基化修饰成功。SLIM205红外光谱在1 080 cm-1、820 cm-1处出现了新的吸收峰,可能分别为—O—SO3H中S=O的伸缩振动峰、C—O—S伸缩振动吸收峰,表明硫酸酯化修饰成功。

2.5LIM205及其衍生物体外抗氧化性

2.5.1LIM205衍生物对Fe2+螯合率的影响

对金属离子的螯合作用是抗氧化剂的一个重要性质[25]。Ferrozine定量与Fe2+结合形成红色络合物,当黑色素存在时,黑色素与Ferrozine竞争Fe2+与络合,导致络合物的红色变浅,因此可通过颜色的变化来测定黑色素对Fe2+的螯合作用。LIM205、CLIM205、SLIM205质量浓度对Fe2+的螯合率如图4所示,由图4可看出,LIM205、CLIM205、SLIM205对Fe2+的螯合率均随其质量浓度的增大而增强,当质量浓度为300 mg/L时,对Fe2+的螯合率分别达到了25.60%、54.50%、42.15%,低于EDTA-2Na对Fe2+的螯合率(61.11%),LIM205、CLIM205、SLIM205均具有螯合Fe2+的能力,可能是由于该黑色素分子中高电荷密度的羧基或羟基与带电的Fe2+作用,因此,LIM205、CLIM205可作为螯合Fe2+的螯合剂。

图4　LIM202及其衍生物质量浓度对Fe2+的螯合率的影响

2.5.2LIM205衍生物对·OH清除率的影响

LIM205及其衍生物对·OH的清除率的影响如图5所示,LIM205、CLIM205、SLIM205对·OH的清除作用均随其质量浓度的增大而增强,且当质量浓度为300 mg/L时均达到最大,分别为57.27%、73.39%、61.73%。相同质量浓度条件下,CLIM205对·OH的清除作用比LIM205和SLIM205强,且最大清除率高于LachnumYM-223黑色素对·OH的清除力(50.60%)[26],略低于Vc(78.90%),表明羧甲基修饰后的黑色素对·OH的清除能力增强。

图5　LIM205及其衍生物对·OH清除率的影响

2.5.3LIM205衍生物对O2-·清除率的影响

邻苯三酚在碱性条件下能够迅速自氧化,生成吸收波长在318 nm附近的系列有色中间产物,同时释放出O2-·,因此可通过比色法来检验物质清除O2-·的能力，结果如图6所示。

图6　LIM205及其衍生物对O2-·清除率的影响

由图6可知,LIM205、CLIM205、SLIM205对O2-·的清除能力,均随其质量浓度的增大而增大。当质量浓度为300 mg/L时,LIM205、CLIM205、SLIM205对O2-·的最大清除率分别达到46.76%、77.20%、53.62%,均高于Lachnumsingerianum对O2-·的清除力(43.48%)[18]。CLIM205对O2-·的最大清除能力略高于Vc (75.73%),且相同质量浓度条件下,CLIM205和SLIM205对O2-·的清除率均大于LIM205的,且CLIM205对O2-·的清除活性大于SLIM205的,差异极显著(P< 0.01)。

2.5.4LIM205衍生物对DPPH·清除率的影响

LIM205及其衍生物对DPPH·清除率的影响如图7所示。

由图7可以看出,LIM205、CLIM205、SLIM205对DPPH·的清除能力随其质量浓度的增加而增大。当质量浓度为300 mg/L时,三者对DPPH·的清除率为49.72%、67.40%、54.19%。修饰后的黑色素清除DPPH·能力明显增强,其中CLIM205对DPPH·清除率的活性最高,但略低于BHT。

图7　LIM205及其衍生物对DPPH·清除率的影响

3结束语

本研究对LIM205进行了羧甲基化修饰和硫酸酯化修饰,获得了水溶性黑色素,溶解度分别为3.75、2.06 g;LIM205、CLIM205、SLIM205对OH·、O2-·、DPPH·的清除率及Fe2+的螯合率均随其质量浓度增加而增强,相同质量浓度时三者抗氧化能力关系为CLIM205> SLIM205> LIM205;质量浓度为300 mg/L时,与LIM205相比,SLIM对OH·、O2-·、DPPH·的清除率及Fe2+的螯合率分别提高了3.46%、6.87%、4.47%、16.5%,而CLIM205分别提高了16.13%、30.44%、17.32%、28.90%。实验结果表明,黑色素经羧甲基化修饰和硫酸酯化修饰后,水溶性和生物活性均提高,这可能是由于黑色素引入了新的基团,从而影响了LIM205的水溶解度和抗氧化活性。

本研究获得的水溶性的CLIM205和SLIM205均可作为一种新型抗氧化剂用于食品和医药行业,但CLIM205和SLIM205的水溶解度仍然偏低,可通过优化羧甲基化修饰和硫酸酯化修饰的工艺条件或探索其他的改性方法来进一步提高黑色素的水溶性。

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(责任编辑闫杏丽)

Molecular modifications of melanin fromLachnumand their antioxidative activities

LI Lan,YUAN Huai-bo,LI Sheng-lan,YE Ming

(School of Biotechnology and Food Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China)

Abstract:By using carboxymethylation and sulfation to modify the homogeneous component melanin(LIM205) from Lachnum sp, a water-soluble melanin carboxymethylate(CLIM205) and a melanin sulfate(SLIM205) were obtained and the modifications were successfully verified by UV and FT-IR spectra. LIM205 was insoluble in water under the temperature of 30 ℃, however, it became a water-soluble melanin after carboxymethylation and sulfation. The water solubility of CLIM205 and SLIM205 were 3.75 g and 2.06 g. The abilities of LIM205, CLIM205 and SLIM205 to scavenge OH·, O2-·, DPPH· and to chelate Fe(2+)were tested, and the antioxidative activities in vitro were also evaluated. At the same dosage, the antioxidative activities of CLIM205 and SLIM205 were both higher than those of LIM205, and the antioxidative activities of CLIM205 were higher than those of SLIM205, suggesting that CLIM205 and SLIM205 can be used as new antioxidant components in medicine and health products.

Key words:Lachnum melanin; water solubility; carboxymethylation; sulfation; antioxidative activity

中图分类号:Q939.9

文献标识码：A

文章编号：1003-5060(2016)03-0404-06

doi:10.3969/j.issn.1003-5060.2016.03.022

作者简介：李兰(1988-)，女，安徽亳州人，合肥工业大学硕士生；

基金项目：国家自然科学基金资助项目(31270060)；科技部中小企业技术创新资助项目(12C26213403307)

收稿日期：2015-01-06

叶明(1959-)，男，安徽怀宁人，博士，合肥工业大学教授，博士生导师.