苯肾上腺素对心肌纤维化的调节和对白细胞介素-1、白细胞介素-6及肿瘤坏死因子-α的影响

王硕，庞晓，曹慧



苯肾上腺素对心肌纤维化的调节和对白细胞介素-1、白细胞介素-6及肿瘤坏死因子-α的影响

王硕，庞晓，曹慧

摘要

关键词肾上腺素α1受体激动剂；心肌纤维化；白细胞介素-1；白细胞介素-6；肿瘤坏死因子-α

作者单位：832002 新疆维吾尔自治区石河子市，石河子大学医学院第一附属医院 心内科

Impacts of Phenylephrine on Myocardial Fibrosis Regulation and Interleukin-1,Interleukin-6,Tumor Necrosis Factor-α Expressions in Experimental Mice

WANG Shuo,PANG Xiao,CAO Hui.
Department of Cardiology,First Affiliated Hospital of Shihezi University Medical College,Shihezi(832002),Xinjiang,China
Corresponding Author:PANG Xiao,Email:px0993@163.com

Abstract

Objective:To explicit phenylephrine(PE),α1-adrenergic receptor(α1-AR)on myocardial fibrosis regulation and interleukin-1(IL-1),IL-6,tumor necrosis factor-α(TNF-α)expressions in pressure overloaded mice.

Methods:A total of 49 KM mice were randomly divided into 3 groups:Blank control group,n=7,Sham operation group,n=7,Transverse abdominal aortic constriction(TAC)group,n=35,and 8 weeks later,the mice in TAC group were further divided into 5 sub-groups as TAC control,TAC+PE,TAC+Praz,TAC+Prop,TAC+Carv sub-groups,n=5 in each sub-group,and the animals were respectively treated for 3 weeks.Left ventricular collagen volume fraction(CVE),hydroxyproline content and IL-1,IL-6,TNF-α expressions were examined respectively.

Results:By 8 weeks treatment,compared with Blank control group,TAC group had obvious myocardial fibrosis,increased hydroxyproline content and IL-1,IL-6,TNF-α expressions,P<0.001.Compared with TAC control sub-group,TAC+PE,AC+Prop,TAC+Carv sub-groups showed decreased CVF,hydroxyproline content and IL-1,IL-6,TNF-α expressions,P<0.001,while the above changes were not obvious in TAC+Praz sub-group,P>0.05;CVE and hydroxyproline content were similar between TAC+PE and TAC+Prop sub-groups,while the expressions of IL-1,IL-6 and TNF-α were obviously decreased in TAC+Prop sub-group,P<0.05.Conclusion:PE may improve myocardial fibrosis and IL-1,IL-6,TNF-α expressions by activating α1-AR in pressure overloaded mice,α1-AR might be a defending factor for myocardial fibrosis.

Key words Adrenergic alpha-1 receptor agonists;Myocardial fibrosis;Interleukin-1;Interleukin-6;Tumor necrosis factor-α

(Chinese Circulation Journal,2016,31:289.)

心肌纤维化是指在正常的心脏组织结构中胶原纤维过量积聚、胶原浓度显著升高或胶原成分发生变化，是胶原合成代谢和分解代谢失衡的结果。这种病理表现存在于多种心血管疾病，与心功能障碍、心律失常甚至心原性猝死密切相关。交感神经系统活性增加在心血管病的发生、发展中有着重要的作用[1]。基础实验与临床研究已证实，β肾上腺素能受体（β-AR）阻滞剂能够延缓心血管病进展，降低心力衰竭的发病率和死亡率[2]，但是，与β-AR在心脏中的作用已受到广泛关注不同，有关α1肾上腺素能受体（α1-AR）的研究报道较少。

炎症因子在多种疾病所致的心肌纤维化进程中起着重要作用。各种致病因素导致心肌组织炎性细胞浸润、炎症因子水平异常增高，刺激心脏胶原纤维合成增多，最终导致心肌纤维化。急性心肌梗死后的梗死区和非梗死区都存在炎性细胞浸润和心肌纤维化，且炎症因子的水平与纤维化的程度密切相关。炎症因子在心肌纤维化过程中形成了一个复杂的调节网络，在炎症因子的刺激下，发生纤维化的心肌组织进一步分泌炎症因子，从而导致恶性循环。

本实验通过腹主动脉缩窄（TAC）诱导小鼠压力超负荷模型，在小鼠出现心肌纤维化后，分别予α1-AR激动剂苯肾上腺素（PE）、α1-AR抑制剂哌唑嗪（Praz）、β1/β2受体阻滞剂普萘洛尔（Prop）和α1/β1/β2受体阻滞剂卡维地洛（Carv）处理，明确α1-AR在心肌纤维化过程中的作用，并且观察炎症因子白细胞介素-1（IL-1）、白细胞介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）在α1-AR调节的心肌纤维化过程中的变化。

1　材料与方法

实验动物及分组：昆明（KM）小鼠49只，雄性，8周龄，体重22～25 g，购自新疆石河子大学实验动物中心。实验室喂养适应1周后，记录体重、活动状态作为基线资料，随后将动物随机分为3组：（1）TAC组（n=35）：分离小鼠腹主动脉，在肾脏水平用6号手术线将腹动脉和0.18 mm针头一起结扎；（2）假手术组（n=7）：只分离腹主动脉，不结扎；（3）空白对照组（n=7）。8周后重新记录体重、活动状态，将TAC组随机分为5组，每组7只：TAC+PE组（每日PE 0.65 mg/kg腹腔注射）、TAC+Praz组（每日Praz 5 mg/kg灌胃）、TAC+Prop组（每日Prop 40 mg/kg灌胃）、TAC+Carv组（每日Carv 10 mg/kg灌胃）和TAC对照组（每日生理盐水灌胃）。3周后处死小鼠。

心肌羟脯氨酸测定：羟脯氨酸试剂盒购自南京建成生物工程研究所。按试剂盒说明操作，测定左心室心肌组织中羟脯氨酸含量。间质胶原平均包含13.4% 羟脯氨酸，间质胶原含量等于羟脯氨酸的含量乘以7.46[3]，结果以μg /mg 表示每毫克心脏组织中胶原的含量[4]。

心肌胶原形态学观察及定量分析：石蜡包埋，切片厚约4 μm，用Van-Gieson（VG）染色法，光镜下可见心肌细胞呈黄色，胶原呈红色。然后用Image-Pro 6.0图像分析软件进行图像分析，测量左心室的胶原容积分数（CVF），CVF=左心室胶原面积/所测视野面积。随机取6个视野，以均值作为该心脏的CVF。

免疫组织化学法测定心肌IL-1、IL-6和TNF-α表达情况：石蜡切片，常规脱蜡，3 ml/L过氧化氢灭活内源性过氧化物酶，热修复抗原后，滴加一抗IL-1（1:200 稀释，购自博士德公司）、IL-6 （1:100 稀释，购自奥博森公司）、TNF-α（1:200 稀释，购自博士德公司），4℃过夜；滴加生物素标记的二抗，37℃孵育30 min；加辣根酶标记的链霉卵白素工作液；二氨基苯联胺（DAB）显色，封片。应用Image-Pro 6.0图像分析软件对IL-1、IL-6、TNF-α（细胞质中棕褐色颗粒为阳性）蛋白表达进行图像分析，每张切片取5 个连续的高倍视野，在阳性表达区随机选择5 个视野，通过image-Pro6.0分析测定平均阳性表达率，其值越高，表达量越多，进行半定量分析。

统计学处理：应用SPSS 17.0 软件包对数据进行统计分析。各组计量资料数据以表示。三组间比较在方差齐时用方差分析，两两比较用LSD。P<0.05 为差异有统计学意义。

2　结果

七组小鼠VG 染色以及胶原容积分数、羟脯氨酸和胶原含量结果（图1、表1）：空白对照组及假手术组小鼠心脏组织可见少量纤维组织，TAC对照组、TAC+Praz组小鼠心肌细胞排列紊乱，心肌内小血管周围及心肌间质有较多胶原沉积，左心室CVF较空白对照组明显增高（P<0.01）；TAC+PE组、TAC+Prop组、TAC+Carv组心肌胶原沉积较TAC对照组减少，CVF 显著降低（P<0.01），但仍高于空白对照组（P<0.01）；TAC+PE组心肌胶原沉积较TAC+Carv组减少，CVF降低（P<0.01），TAC+Prop组心肌胶原沉积较TAC+Carv组减少，CVF降低（P<0.05）。TAC对照组、TAC+Praz组小鼠心肌组织中羟脯氨酸和胶原含量较空白对照组显著升高（P<0.01）；TAC+PE组、TAC+Prop组、TAC+Carv组小鼠心肌组织中羟脯氨酸和胶原含量较TAC对照组减少（P<0.01），但仍高于空白对照组（P<0.01），TAC+PE组小鼠心肌组织中羟脯氨酸和胶原含量较TAC+Carv组减少（P<0.01），TAC+Prop组小鼠心肌组织中羟脯氨酸和胶原含量较TAC+Carv组减少（P<0.05）。

七组小鼠心肌组织中IL-1、IL-6和TNF-α的表达情况（图2、表2）：心肌组织中IL-1、IL-6和TNF-α在心肌细胞胞浆表达。TAC对照组、TAC+Praz组小鼠心肌组织中IL-1、IL-6和TNF-α表达较空白对照组显著升高（P<0.01）；TAC+PE组、TAC+Prop组、TAC+Carv组小鼠心肌组织中IL-1、IL-6和TNF-α表达较TAC对照组减少（P<0.01），但仍高于空白对照组（P<0.01），TAC+PE组小鼠心肌组织中IL-1、IL-6和TNF-α表达较TAC+Carv组减少（P<0.01），TAC+Prop组小鼠心肌组织中IL-1、IL-6和TNF-α较TAC+Carv组减少（P<0.05）。

图1　七组小鼠Van-Gieson染色胶原形态学观察（×100）

表1　七组小鼠胶原容积分数及羟脯氨酸和胶原含量比较（n=7，±s）

表2　七组小鼠心肌组织中白细胞介素-1、白细胞介素-6和肿瘤坏死因子-α的含量（IOD）比较（n=7，±s）

表2　七组小鼠心肌组织中白细胞介素-1、白细胞介素-6和肿瘤坏死因子-α的含量（IOD）比较（n=7，±s）

注：IOD：光密度，通过Image-Pro 6.0软件测定定量分析所得，反映蛋白单位面积浓度，与蛋白定量呈对数关系。与空白对照组相比*P<0.01；与腹主动脉缩窄对照组相比△P<0.01；与腹主动脉缩窄+卡维地洛组相比▲P<0.01▲▲P<0.05

组别　白细胞介素-1(D/µm2)　白细胞介素-6(D/µm2)　肿瘤坏死因子-α(D/µm2))空白对照组　2.16±0.14△▲　3.71±0.53△▲2.45±0.26△▲假手术组　2.61±0.65△▲　4.22±0.41△▲　2.70±0.34△▲腹主动脉缩窄对照组　43.56±1.76*▲　46.75±0.76*▲　43.49±2.14*▲腹主动脉缩窄+苯肾上腺素组　5.34±0.30*△▲　8.59±0.32*△▲　6.57±0.58*△▲腹主动脉缩窄+哌唑嗪组　42.54±1.98*▲　47.00±1.28*▲　42.78±2.35*▲腹主动脉缩窄+普萘洛尔组　18.97±0.82*△▲▲　20.22±1.51*△▲▲　19.50±1.99*△▲▲腹主动脉缩窄+卡维地洛组　21.39±1.47*△　21.85±0.29*△　22.19±1.01*△

图2　免疫组织化学法检测七组小鼠白细胞介素-1、白细胞介素-6和肿瘤坏死因子-α表达情况

3　讨论

心肌纤维化是多种心血管病不断进展最终导致心脏功能衰竭的一个重要病理改变，是心肌重构的关键病理特征和重要形成原因。其主要表现为心肌组织中胶原纤维过度沉积，胶原含量显著增加，各型胶原比例失调且排列紊乱。目前认为，心肌纤维化过程中的靶细胞主要是成纤维细胞，研究比较明确的刺激因素有：肾素-血管紧张素-醛固酮系统、细胞因子以及压力超负荷等。最终影响心肌细胞外基质（ECM）沉积的表达产物或使ECM过度增生，或使ECM降解异常，主要与基质金属蛋白酶（MMP）及其组织抑制因子（TIMP）的平衡失调有关[5]，而成纤维细胞的增殖异常则受某些细胞周期因子的调控。IL-1、IL-6和TNF-α被认为是心肌纤维化过程中的胞外刺激因素，它们可以对上述某些环节产生影响。

交感神经系统作为多种心脏病理生理状态的重要刺激因素之一，已被很多研究所证实。临床和动物遗传学研究均显示，α1-AR在心肌细胞生长发育和病理肥厚中有着重要的作用[6]，但对于α受体阻滞剂对心肌纤维化的作用研究较少。

本研究采用TAC法建立压力超负荷小鼠模型，TAC组小鼠心肌组织中总胶原（VG染色）及羟脯氨酸含量明显增多，证实压力超负荷导致小鼠心肌纤维化的发生，IL-1、IL-6和TNF-α表达也较空白对照组明显升高，这与有关研究报道[7-9]相同。给予PE、Prop、Carv对心肌纤维化小鼠进行干预后，这三组小鼠的CVF、羟脯氨酸含量均较TAC对照组明显降低，但仍高于空白对照组，表明PE、Prop、Carv均可部分缓解压力超负荷诱导的心肌纤维化；TAC+PE组、TAC+Prop组小鼠的CVF、羟脯氨酸含量与TAC+Carv组相比明显降低，表明PE、Prop对压力超负荷诱导心肌纤维化的缓解作用优于Carv；给予Praz对心肌纤维化小鼠进行干预后，CVF、羟脯氨酸含量均较TAC对照组无明显降低，表明Praz对压力超负荷诱导的心肌纤维化无明显影响；提示激活α1-AR或抑制β-AR可部分缓解压力超负荷诱导的心肌纤维化，且抑制β-AR的同时抑制α1-AR会部分降低β-AR对压力超负荷诱导的心肌纤维化的缓解作用。TAC+PE组小鼠IL-1、IL-6 和TNF-α表达较TAC+Prop组和TAC+Carv组明显降低，TAC+Prop组小鼠IL-1、IL-6和TNF-α表达较TAC+Carv组降低，表明PE缓解压力超负荷诱导的心肌纤维化的同时伴随着IL-1、IL-6和TNF-α表达的降低；虽然TAC+PE组与TAC+Prop组小鼠心肌纤维化程度无显著差异，但TAC+PE组小鼠IL-1、IL-6和TNF-α表达明显低于TAC+Prop组，提示PE与Prop缓解压力超负荷诱导的心肌纤维化的机制可能不同，且PE缓解压力超负荷诱导的心肌纤维化可能影响IL-1、IL-6和TNF-α的表达。

在正常心脏的所有受体中，β-AR大约占90%，而α1-AR约占10%。β-AR抑制对心力衰竭有明显的益处，但有临床研究结果表明，在心力衰竭患者中过多降低去甲肾上腺素水平是有害的[10]。有研究提示，心力衰竭时α1-AR数量并没有下调，而是相应提高，通过激活生理性肥厚、阻止细胞死亡和增加正性肌力反应保护心脏，预防病理性心室重构[11]，使得我们不得不重新审视α1-AR的功能。

本研究证实，PE可以有效减轻压力超负荷诱导小鼠的心肌纤维化，因此我们推测，早期使用α1受体激动剂可能会改善心肌纤维化程度，减缓心室重构发生、发展的病理进程。本研究还观察到PE对心肌纤维化的调节伴随IL-1、IL-6和TNF-α表达的降低，但具体机制尚不清楚，需进一步证实及探讨。

参考文献

[1]Siwik DA,Colucci WS.Regulation of matrix metalloproteinasesby cytokines and reactive oxygen/nitrogen species in the myocardium.Heart Fail Rev,2004,9:43-51.

[2]张健.β受体阻滞剂在心力衰竭治疗中的应用.中国循环杂志,2009,24:391-393.

[3]Grant RA.Technical methods-estimation of hydroxyproline by the autoanalyser.J Clin Path,1964,17:685.

[4]刘芳,李德富.羟脯氨酸含量的测定方法与应用.中国皮革,2007,15:51-54.

[5]王丽萍,杨方.基质金属蛋白酶及其抑制因子与心肌纤维化.中国动脉硬化杂志,2005,13:517-519.

[6]Woodcock EA,Du XJ,Reichelt ME,et al.Cardiac α1-adrenergic drive in pathological remodeling.Cardiovasc Res,2008,77:452-462．[7]Siwik DA,Chang DL,Colucci WS,et al.Interleukin-1 beta and tumor necrosis factor-alpha decrease collagen synthesis and increase matrix metalloproteinase activity in cardiac fibroblasts in vitro.CircRes,2000,86:1259-1265.

[8]陈永清,赵连友,郑强荪,等.白细胞介素-6在心脏成纤维细胞增殖及心肌纤维化过程中的作用.中国临床康复,2004,6:1034-1035.

[9]赵地,王维,张小娟,等.阿托伐他汀对小鼠压力负荷诱导的心室重构的保护作用及机制研究.中国循环杂志,2015,11:1090-1095.

[10]Swedberg K,Bristow MR,Cohn JN,et al.Effects of sustained-release moxonidine,an imidazoline agonist,on plasma norepinephrine in patients with chronic heart failure.Circulation,2002,105:1797-1803.[11]O'Connell TD,Jensen BC,Baker AJ,et al.Cardiac alpha1-adrenergic receptors:novel aspects of expression,signaling mechanisms,physiologic function,and clinical importance.Pharmacol Rev,2014,66:308-333.

（编辑：朱柳媛）

收稿日期：（2015-08-30）

中图分类号：R54

文献标识码：A

文章编号：1000-3614（2016）03-0289-05

doi:10.3969/j.issn.1000-3614.2016.03.020

作者简介：王硕 硕士研究生 研究方向为心血管疾病基础与临床 Email：ddd456852@ 126.com 通讯作者：庞晓 Email：px0993@163.com

目的：明确α1肾上腺素能受体（α1-AR）激动剂苯肾上腺素（PE）在压力超负荷诱导心肌纤维化过程中的作用，观察该过程中炎症因子白细胞介素-1（IL-1)、白细胞介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的变化。

方法：昆明（KM）小鼠49只，随机分成空白对照组、腹主动脉结扎（TAC）组和假手术组，8周后再将TAC组小鼠随机分为5组，包括TAC对照组、TAC+PE组、TAC+哌唑嗪（Praz）组、TAC+普萘洛尔（Prop）组和TAC+卡维地洛（Carv）组，分别给予不同的药物处理3周后，测定小鼠左心室组织胶原容积积分（CVF）、羟脯氨酸含量以及炎症因子IL-1、IL-6 和TNF-α的表达变化。

结果：TAC 8周后，小鼠出现明显心肌纤维化，左心室组织CVF、羟脯氨酸含量以及IL-1、IL-6和TNF-α的表达均较空白对照组显著增高（P<0.01）；与TAC组相比，TAC+PE组、TAC+ Prop组和TAC+Carve组的左心室CVF、羟脯氨酸含量及IL-1、IL-6、TNF-α的蛋白表达均明显降低（P<0.01），而TAC+Praz组的左心室CVF、羟脯氨酸含量及IL-1、IL-6、TNF-α表达变化不明显（P>0.05）；与TAC+PE组相比，TAC+Prop组左心室CVF、羟脯氨酸含量差异无统计学意义，但IL-1、IL-6和TNF-α的蛋白表达显著降低（P<0.05）。

结论：PE通过激活α1-AR，可改善压力超负荷诱导的心肌纤维化和炎症因子IL-1、IL-6及TNF-α的表达，α1-AR可能是心肌纤维化的防御因素。