福辛普利对慢性心力衰竭大鼠心肌细胞凋亡及相关基因表达的影响

谢亚芹，赵娟，李秀华，冯翔宇



福辛普利对慢性心力衰竭大鼠心肌细胞凋亡及相关基因表达的影响

谢亚芹，赵娟，李秀华，冯翔宇

摘要

关键词福辛普利；心力衰竭；细胞凋亡；凋亡相关基因

作者单位:067000 河北省承德市，承德医学院 病理生理学教研室(谢亚芹、赵娟)； 承德医学院附属医院 老年病科(李秀华、冯翔宇)

Effect of Fosinppril on Myocardial Cell Apoptosis and Apoptosis-associated Gene Expression in Chronic Heart Failure Rats

XIE Ya-qin,ZHAO Juan,LI Xiu-hua,FENG Xiang-yu.
Department of Pathophysiology,Chengde Medical College,Chengde(067000),Hebei,China
Corresponding Author:XIE Ya-qin,Email:xieyq1983@126.com

Abstract

Objective:To investigate the effects of fosinppril on myocardial cell apoptosis and apoptosis-associated gene expression in chronic heart failure(CHF)rats.

Methods:CHF model was established by partially banding of abdominal aorta superior to renal artery.The experimental rats were randomly divided into 3 groups:Sham operation group and CHF group,the rats in both groups received stomach normal saline;Fosinopril group,the rats received stomach fosinopril 10 mg/kg•d.n=10 in each group and all animals were treated for 8 weeks.LVEDP,±dp/dtmaxand LVMI were examined,left ventricular myocardial cell apoptotic index(AI)was measured by TUNEL method,Bcl-2 and Bax protein levels were detected by immunohistochemistry and caspase-3 protein expression was assessed by Western blotting.

Results:Compared with Sham operation group,CHF group had increased LVEDP,LVMI,AI,elevated protein expressions of Bax and Caspase-3,P<0.01;while decreased ±dp/dtmax,reduced protein expression of Bcl-2 and the ratio of Bcl-2/Bax,P<0.01.Compared with CHF group,Fosinopril group presented decreased LVEDP,LVMI,AI,reduced protein expressions of Bax and Caspase-3,P<0.01;while increased ±dp/dtmax,elevated protein expression of Bcl-2 and the ratio of Bcl-2/Bax,P<0.01.Conclusion:Fosinopril may inhibit myocardial cell apoptosis which occurred during CHF,by up-regulating Bcl-2 expression and down-regulating expressions of Bax and Caspase-3 in CHF rats,therefore improve the cardiac function.

Key words Fosinopril;Hear failure;Apoptosis;Apoptosis-associated gene

(Chinese Circulation Journal,2016,31:285.)

慢性心力衰竭是各种病因导致心脏疾病的严重阶段及最终归宿，也是心脏疾病患者最主要的死亡原因。近年来有研究证明[1]，长效血管紧张素转化酶抑制剂（ACEI）类药物在治疗高血压的同时可使心肌肥厚逆转，使扩大的心脏恢复正常，降低心脏负荷，改善心室功能，降低心力衰竭的死亡率。但其能否有效抑制长期慢性压力超负荷引起的心力衰竭心肌细胞凋亡仍需进一步研究。本研究将以肾上腹主动脉缩窄方式建立慢性压力负荷型心力衰竭动物模型，分析福辛普利对慢性心力衰竭大鼠心肌细胞凋亡及相关调节基因表达的影响，探讨其在积极逆转心肌受损，改善心力衰竭进程中的作用，为临床药物治疗的研究提供理论基础。

1　材料与方法

材料： 2014-01至2015-01选取清洁级雄性Wistar大鼠35只,购自北京华阜康生物科技股份有限公司（合格证编号：2009-0004）；福辛普利(10 mg)商品名：蒙诺，购自中美上海施贵宝制药有限公司；脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL）细胞凋亡检测试剂盒购自美国罗氏（Roche）公司；B细胞白血病/淋巴瘤相关抗原2（Bcl-2）、B细胞白血病/淋巴瘤相关抗原相关X（Bax）和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3 （Caspase-3）兔抗多克隆抗体均购自北京博奥森生物技术有限公司；SP免疫组化试剂盒购自北京中杉金桥生物技术公司；二奎啉甲酸（BCA）法蛋白定量试剂盒购自北京泰格美科技有限公司。

动物模型的建立及分组：将35只大鼠适应性喂养1周后，随机抽取10只作为假手术组，假手术组只分离腹主动脉而不结扎。其余25只大鼠全部采用肾上腹主动脉缩窄手术建立慢性心力衰竭模型[2,3]。术后均给予青霉素20万U连续3天腹腔注射，常规喂养6周，造模大鼠逐渐出现呼吸、心跳加快、倦怠无力、食欲减退等表现，模型建立中死亡5只。检测血流动力学参数，以左心室舒张末压（LVEDP）≥15 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）作为成模标准，待成功建立模型后，福辛普利组（n=10）大鼠给予福辛普利10 mg/（kg·d），慢性心力衰竭组（n=10）和假手术组大鼠给予等量生理盐水灌胃，连续8周。

血流动力学监测：将大鼠测体重后，10%水合氯醛腹腔注射麻醉（0.5 g/kg）大鼠，经右颈总动脉逆行插管至左心室，另一端接压力换能器输入多媒体生物信号记录仪系统，记录分析后获得LVEDP，左心室内压最大上升和下降速率（±dp/dtmax)等。

标本制备及计算左心室质量指数（LVMI）：福辛普利治疗结束后，10%水合氯醛腹腔注射麻醉（0.5 g/kg）大鼠，进行血流动力学监测后，迅速开胸取出心脏，冰生理盐水洗净，分离左心室，取左心室称重后，将部分放入4%多聚甲醛固定24 h，常规脱水、透明、浸蜡和包埋，备用于免疫组织化学染色检测Bcl-2、Bax蛋白表达；其余左心室迅速投入液氮中保存，备用于蛋白免疫印记法（Western blotting）检测Caspase-3蛋白表达。LVMI=大鼠左心室质量/大鼠体重。

TUNEL法原位检测细胞凋亡：石蜡切片常规脱蜡至水，蛋白酶K（proteinase K）工作液消化15 min，TUNEL反应液37℃孵育60 min，过氧化物酶（POD）转化剂37℃孵育30 min，二氨基联苯胺（DAB）显色，苏木素复染，脱水，透明，封片。凋亡细胞的细胞核呈棕褐色着染。凋亡指数（AI）的确定：以TUNEL阳性细胞数目与同一视野心肌细胞总数的比值作为左心室心肌细胞凋亡指数，每只动物任选3张切片，每张切片选取4个视野，取平均值。

免疫组织化学检测Bcl-2、Bax蛋白的表达：采用SP免疫组织化学染色方法检测左心室心肌组织Bcl-2、Bax蛋白的表达。Ⅰ抗分别为Bcl-2、Bax多克隆抗体，稀释浓度均为1:100。实验同时以0.01 mmol/L磷酸盐缓冲液（PBS，pH=7.4）代替第1抗体作为阴性对照，以胞浆中出现棕黄色颗粒为阳性反应，采用MiVnt图像分析系统在10×20倍显微镜下对免疫阳性结果进行半定量分析，以免疫阳性产物面积与视野面积的比值表示该抗原的相对含量。每只动物任选3张切片，每张切片选取4个视野，取平均值。

Western blotting检测Caspase-3蛋白表达：称取左心室心肌组织，BCA蛋白试剂盒测定总蛋白含量[4]。取蛋白质样品每份100μg，与5×loading buffer混匀，100℃煮沸5min，12%十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），转膜，在丽春红染液中染色观察蛋白转移情况并标出蛋白质分子量标准，然后用含5%脱脂牛奶的0.5‰TBST封闭缓冲液（含有Tris-HCl、NaCl、Tween-20，pH=8.0）中封闭，4℃过夜，洗膜后加入1:200羊抗Caspase-3多克隆抗体、1:1 000小鼠抗β肌动蛋白（β-actin）进行杂交，再洗膜后加辣根酶标记的相应的二抗（工作浓度1:5 000）进行杂交，洗膜后加入免疫印迹化学发光试剂最后进行放射自显影。胶片扫描后，采用Quantity One-v 4.6.2软件对显影条带进行分析，计算Caspase-3条带与β-actin条带灰度比值，作为Caspase-3蛋白表达的相对水平。

2　结果

血流动力学参数及LVMI检测结果（表1）：与假手术组相比，慢性心力衰竭组大鼠LVEDP、LVMI显著增高（P<0.01），±dp/dtmax明显下降（P<0.01）；与慢性心力衰竭组相比，福辛普利组大鼠LVEDP、LVMI明显下降（P<0.01）、±dp/dtmax明显上升（P<0.01）,差异均有统计学意义。

心肌细胞凋亡检测结果（表2、图1）：TUNEL阳性产物位于胞核，呈棕褐色颗粒状。与假手术组比较，慢性心力衰竭组大鼠心肌组织细胞凋亡明显增多，AI明显增高（P<0.01）；与慢性心力衰竭组比较,福辛普利组大鼠心肌组织细胞AI明显降低（P<0.01），差异均有统计学意义。

免疫组织化学法检测心肌组织Bcl-2和Bax蛋白表达结果（图2、3，表2）：Bcl-2和Bax免疫阳性产物呈棕黄色，位于心肌细胞浆。与假手术组相比，慢性心力衰竭组大鼠心肌组织Bax蛋白表达明显增高（P<0.01），Bcl-2蛋白表达及Bcl-2/Bax比值明显降低（P<0.01）。与慢性心力衰竭组相比，福辛普利组大鼠心肌组织Bax蛋白表达明显降低（P<0.01），Bcl-2蛋白表达及Bcl-2/Bax比值显著升高（P<0.01），差异均有统计学意义。

表1　各组大鼠血流动力学参数及LVMI比较（n=10，±s）

表2　各组大鼠左心室心肌细胞凋亡指数及心肌组织Bcl-2、Bax蛋白表达（n=10，±s）

图1　缺口末端标记法检测各组大鼠心肌细胞凋亡(×200)

图2　免疫组化染色检测各组大鼠左心室心肌组织Bcl-2蛋白表达(×200)

图3　免疫组化染色检测各组大鼠左心室心肌组织Bax蛋白表达(×200)

Western blotting法检测Caspase-3蛋白的表达结果（图4）：慢性心力衰竭组大鼠心肌组织Caspase-3蛋白表达水平为0.66±0.08，与假手术组0.22±0.03比较明显增高（P<0.01），福辛普利组Caspase-3蛋白表达水平为0.45±0.05，与慢性心力衰竭组比较显著降低（P<0.01），差异均有统计学意义。

图4　蛋白免疫印记法检测各组大鼠左心室心肌组织Caspase-3蛋白表达

注：1：假手术组；2：慢性心力衰竭组；3：福辛普利组。Caspase-3：半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3；β-actin：β肌动蛋白

3　讨论

目前研究表明[5]，心肌细胞的凋亡在心力衰竭的病理改变中有着重要的作用。慢性心力衰竭发生时左心室功能的不断恶化是心肌细胞凋亡或（和）剩余的心肌细胞收缩功能代偿不足的结果，而凋亡可能是心肌细胞不断丢失的根源所在[6]。本研究中血流动力学检测结果，LVEDP水平明显升高，+dp/dtmax与-dp/dtmax均降低，表明慢性心力衰竭组大鼠明显出现心功能的恶化，同时LVMI增加，提示慢性心力衰竭组大鼠左心室壁增厚，出现心肌肥厚。TUNEL检测显示慢性心力衰竭组心肌细胞凋亡指数显著升高。因此提示在慢性压力负荷增加时，可发生心肌细胞的凋亡及心肌纤维化，并最终导致心功能的恶化。

心肌细胞凋亡是受基因调控的细胞主动死亡过程，目前已知的凋亡调节蛋白中，Bcl-2家族与Caspase家族为最关键的两大类[7]。Bcl-2是一种抑制细胞凋亡的基因，而Bax是促进细胞凋亡的基因。Bcl-2与Bax形成的异源二聚体中两者的比例决定促进细胞凋亡还是抑制凋亡[8]。因此，两种基因在细胞中含量和功能之间的平衡一直被认为是决定促凋亡因素刺激后细胞的存活或死亡重要机制[9]，所以Bcl-2 和Bax是调控心肌细胞凋亡的关键基因。本研究发现慢性心力衰竭组大鼠与假手术组比较，Bax表达明显升高，Bcl-2表达及Bcl-2/Bax比值显著降低，提示Bcl-2、Bax确实在心肌细胞凋亡中发挥了关键作用。

Caspase-3被认为是各种凋亡刺激因子激活的Caspase家族中的关键蛋白酶，是细胞凋亡蛋白酶级联反应的必经之路，其活化标志着凋亡进入不可逆阶段[10]。现已证实Caspase-3在心、脑等重要器官缺血再灌注过程及肿瘤细胞[11]均异常表达，参与细胞凋亡。本研究显示发现慢性心力衰竭组大鼠与假手术组比较，Caspase-3蛋白的表达均明显升高，提示Caspase-3在压力负荷型慢性心力衰竭心肌细胞凋亡中发挥了重要作用。

ACEI类药物能使血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）生成减少，并使神经内分泌激素和AngⅡ介导的进行性左心室肥大和扩张受到抑制，增加前列腺素的生成，从而抑制心室重构，被认为是治疗慢性心力衰竭的基石[12]。但大多是ACEI是前体药物，生物利用度较低。福辛普利作为第三代长效ACEI类药物，具有作用时间更长，副作用减少，肝肾双重排泄等优点，因此其在心血管疾病及肾脏损害的治疗等方面得到了越来越多的关注[13]。本研究发现，在福辛普利的作用下，慢性心力衰竭大鼠的心功能得到明显改善，并抑制了心肌肥厚的发生。同时，福辛普利的治疗使心肌细胞凋亡指数、Bax、Caspase-3的表达明显低于慢性心力衰竭组大鼠，Bcl-2表达及Bcl-2/Bax比值较慢性心力衰竭组显著升高。这表明福辛普利通过上调抑制凋亡基因Bcl-2表达、下调促凋亡基因Bax、Caspase-3表达，从而抑制心肌细胞的凋亡，改善心室功能。

参考文献

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(编辑:汪碧蓉)

基础与实验研究

(收稿日期:2015-04-28)

中图分类号：R541.6

文献标识码：A

文章编号：1000-3614（2016）03-0285-04

doi:10.3969/j.issn.1000-3614.2016.03.019

作者简介:谢亚芹 讲师 硕士 研究方向：慢性心力衰竭的发病机制与治疗 Email：xieyq1983@126.com 通讯作者:谢亚芹

基金项目:河北省高校省级重点学科（病理学与病理生理学） 项目

目的： 探讨福辛普利对慢性心力衰竭大鼠心肌细胞凋亡及相关基因表达的影响。

方法： 采用肾上腹主动脉缩窄法建立大鼠慢性心力衰竭模型，随机分为假手术组、慢性心力衰竭组、福辛普利组，每组10只大鼠。术后假手术组和慢性心力衰竭组给予生理盐水灌胃，福辛普利组给予福辛普利10 mg/（kg·d）灌胃。8周后，观察各组大鼠左心室舒张末压（LVEDP）、左心室内压最大上升及下降速率（±dp/dtmax）和左心室质量指数（LVMI）；脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL）检测大鼠左心室心肌细胞的凋亡指数（AI）；SP免疫组织化学染色法检测左心室心肌组织B细胞白血病/淋巴瘤相关抗原2（Bcl-2）、B细胞白血病/淋巴瘤相关抗原相关X（Bax）蛋白的表达；蛋白免疫印记法（Western blotting） 检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3）蛋白的表达。

结果： 慢性心力衰竭组与假手术组相比，大鼠LVEDP、LVMI 、心肌细胞凋亡指数、Bax蛋白、Caspase-3蛋白的表达均明显升高（P<0.01），±dp/dtmax、Bcl-2蛋白的表达、Bcl-2/Bax比值显著下降（P<0.01）；与慢性心力衰竭组比较，福辛普利组大鼠LVEDP、LVMI、心肌细胞凋亡指数、Bax蛋白、Caspase-3蛋白的表达均明显降低（P<0.01），±dp/dtmax、Bcl-2蛋白的表达、Bcl-2/Bax比值显著升高（P<0.01）,差异均有统计学意义。

结论： 慢性心力衰竭过程中发生了心肌细胞凋亡，福辛普利可通过上调Bcl-2的表达及下调Bax及Caspase-3的表达抑制心肌细胞凋亡，改善慢性心力衰竭大鼠心室功能及心肌肥厚。