提高L-缬氨酸发酵生产水平的几种方法

O 黄 平

（福建省麦丹生物集团有限公司福州研究中心 福建 350008）

提高L-缬氨酸发酵生产水平的几种方法

O 黄 平

（福建省麦丹生物集团有限公司福州研究中心 福建 350008）

目前,国内L-缬氨酸工业化生产还存在着许多问题，例如：产酸率低、杂酸比例高、易染菌等，这与日本等国的生产水平还有较大差距。本文归纳了国内缬氨酸产业化过程采取的一些方法，对于L-缬氨酸大规模工业化生产具有一定的参考意义。

L-缬氨酸；发酵生产fv

L-缬氨酸是人体必需的一种支链氨基酸，具有多种生理功能。它被广泛应用于食品、医药及饲料等行业，例如，缬氨酸可以作为食品的营养强化剂和增香剂；在医药工业中用于制造复合氨基酸注射液和用来合成缬沙坦等药物；在饲料行业中可以作为一种限制性氨基酸添加剂，提高动物的生产品质。

由于其用途广泛，市场上高纯度的L-缬氨酸处于供不应求局面，因此，相关生产企业都在努力提高缬氨酸的生产水平。

一、分子改造

目前，国内多数企业使用的L-缬氨酸生产菌株来源反复诱变，遗传背景十分不清晰，很难通过进一步诱变来提高缬氨酸的生产水平。

近年来，随着谷氨酸棒杆菌的全基因组测序及基因功能分析的完成，分子改造已被广泛用于构建缬氨酸高产菌株，成为提高L-缬氨酸发酵生产水平的有效方法。利用已知的谷氨酸棒杆菌遗传学信息，采用基因工程技术改造谷氨酸棒杆菌以提高缬氨酸的产量。

一些适用于用于谷氨酸棒杆菌的表达载体已经被构建，这些表达载体一般为大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌的穿梭载体，有的属于诱导性表达，有属于组成型表达。由于同一启动子在大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌中的活性差别比较大，所以针对谷氨酸棒杆菌中启动子的研究也已经展开，与此同时，在谷氨酸棒杆菌中进行基困敲除的各种方法也被建立。目前，有学者已经从优化启动子、抑制杂酸合成、解除反馈抑制、增加抗性等方面构建出一些高产L-缬氨酸的工程菌。

图1 谷氨酸棒杆菌质粒pGC42

福建省麦丹生物集团有限公司福州研究中心课题组通过分子改造优化了启动子并在质粒pGC42中增加了卡那霉素抗性，质粒图谱见图1，构建了一株L-缬氨酸的工程菌V3，摇瓶产酸由出发菌株的2.3%提高到3.3%，效果十分明显。

二、培养基优化

优良的菌种也需要最佳的培养基条件相匹配才能发挥其生产性能，在缬氨酸发酵培养基中，玉米浆、酵母膏和生物素(VH)是非常重要的组成成分。

玉米浆成分非常复杂，为微生物生长代谢提供所需的各种氨基酸、有机磷、生长因子、核酸等。若玉米浆用量不足，菌体生长繁殖受到限制，菌体浓度达不到高密度要求，对产酸不利；用量过多，则菌体浓度大，消耗过多的营养物质，杂酸比例增多，影响缬氨酸的积累。本课题组经过大量的试验发现玉米浆的质量会显著影响缬氨酸的产量，当玉米浆中的有机磷含量低于2%就会显著影响缬氨酸的产量，一般来说有机磷含量在3%以上的玉米浆质量较为理想。

酵母浸膏富含完全蛋白质，多种氨基酸以及B族维生素、核苷酸、微量元素等，是最为理想的生物培养基原料和发酵工业中的主要原料，可以大大提高菌种的生产速率及发酵产品得率。在缬氨酸种子培养基及发酵培养基中添加适量的酵母膏可以促进菌体生长，但酵母膏过量则会导致菌体密度过大，影响缬氨酸积累。

生物素的浓度会影响细胞壁的合成，进而影响细胞内物质的分泌。当生物素用量过少时，细胞壁合成不足，不利于菌体的生长；用量过多则使细胞壁合成过量，添加影响氨基酸分泌到胞外。

此外，有研究表明，在培养基中添加柠檬酸钠能显著降低枯草芽胞杆菌代谢途径中磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶的活力，柠檬酸和葡萄糖的联合代谢还会减弱糖酵解途径，从而抑制有机杂酸的生成。本课题组在此研究结果的基础上，在谷氨酸棒杆菌的发酵培养基中添加一定量的柠檬酸钠，配方见表1，在30L罐试验结果发现L-缬氨酸的产量可以由原来的6.7%提高到8.2%，杂酸比例由原来的28%降低到15%，效果非常明显。

表1 缬氨酸发酵配方

三、摇瓶菌种筛选

摇瓶培养技术问世于二十世纪30年代，由于其简便、实用，很快便被发展成为微生物培养中极重要的技术而普及，并广泛用于工业微生物菌种筛选、实验室大规模发酵试验、种子培养等，也常用于生产工艺的改良和工艺参数的优化。

由于生产菌种是先经过甘油管保藏后再提供大生产使用，在保藏过程中很有可能出现退化的情况，因此需要重新挑取一定数量单菌落进行筛选，以筛选出生长情况最稳定、产酸水平最高的菌种提供给大生产。

摇瓶筛选的培养基应与大罐发酵培养基保持一致，培养条件也应尽量与大生产相匹配。摇瓶培养结束后通过镜检各摇瓶菌种的生长情况、测定各摇瓶培养基pH值和产酸情况以确定最佳菌种保证提供给大生产。

四、30L小罐菌种验证

菌种的小罐验证也是氨基酸放大生产过程中一个非常重要的环节。提供大生产的菌种虽然经过摇瓶筛选，但依然有可能会出现“水土不服”的情况,表现为菌体生长缓慢，产酸减少甚至直接导致倒罐等严重情况。

原因是摇瓶筛选的条件和大罐生产的条件是两个不同尺度考量的问题，摇瓶产酸高并不完全意味着在发酵罐上会表现良好。

通过30L小罐验证，淘汰产酸不稳定的菌种就可以大大降低此类事情发生的概率，菌种验证是本课题组保障大生产菌种安全稳定的一个重要工作环节。

五、展望

目前，国内生物技术的发展也促使发酵行业的飞速发展，使得L-缬氨酸的生产工艺由以前的技术含量低、劳动强度大、能耗高、转化率低发展到现在的技术含量高，自动化程度高、能耗低、转化率高。随着国内生物技术的进一步发展，缬氨酸的生产水平会逐步提高，逐步达到日本等发达国家的水平。

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Several methods of improving the fermentation production level of L- valine

Huang Ping
（Fujian research center of Fuzhou Province, province, Mai Dan biological Group Co., Ltd.,Fujian,350008）

At present, domestic L-valine industrial production still exist many problems, for example: acid production rate low, heteropoly acid ratio is high, easy to be infected by bacteria and other, the production level of this with Japan and other countries there is a large gap. This paper sums up the domestic valine industrialization process to adopt some methods, for the large-scale industrial production of L-valine has certain reference significance.

L- valine；fermentation FV

T

A

黄平（1982～），男，福建省麦丹生物集团有限公司福州研究中心，研究方向：生物化工、发酵工程。