IFN-γ和IL-1在鼻咽血管纤维瘤中的表达及其意义

吴贤敏 武鹏 叶凡 李志春 杨开颜 林昶 陈晓云▲

1.温州医科大学附属第一医院耳鼻咽喉-头颈外科，浙江温州325000；2.福建医科大学附属第一医院耳鼻咽喉-头颈外科，福建福州350004；3.温州医科大学附属第一医院病理科，浙江温州325000

IFN-γ和IL-1在鼻咽血管纤维瘤中的表达及其意义

吴贤敏1武鹏1叶凡1李志春2杨开颜3林昶2陈晓云1▲

1.温州医科大学附属第一医院耳鼻咽喉-头颈外科，浙江温州325000；2.福建医科大学附属第一医院耳鼻咽喉-头颈外科，福建福州350004；3.温州医科大学附属第一医院病理科，浙江温州325000

目的检测干扰素-γ（interferon-γ，IFN-γ）和白细胞介素-1（interleukin 1，IL-1）在鼻咽血管纤维瘤中的表达水平，探讨IFN-γ和IL-1在鼻咽血管纤维瘤骨质破坏机制中的作用。方法应用免疫组化SP法检测IFN-γ和IL-1在2000～2012年期间20例鼻咽血管纤维瘤和2015年3～6月期间10例正常下鼻甲组织中的表达。结果IFN-γ和IL-1蛋白在JNA中的阳性表达率均为100%，明显高于IFN-γ和IL-1蛋白在下鼻甲组织中的阳性表达率20%（P均＜0.05）。IFN-γ和IL-1蛋白的表达与JNA临床分期无关（P＞0.05）。结论IFN-γ和IL-1在鼻咽血管纤维瘤组织中阳性表达率较高，可能是参与鼻咽血管纤维瘤骨质破坏的相关因素。

干扰素-γ；白细胞介素-1；鼻咽血管纤维瘤；免疫组化

鼻咽血管纤维瘤（juvenile nasopharyngeal angiofibroma，JNA）为鼻咽部最常见的良性肿瘤，常发生于10～25岁的青年男性，由大量的血管、弹性纤维及致密结缔组织组成，Liang等［1］认为其本质是血管错构瘤。虽然JNA是良性肿瘤，但其破坏颅底及周围骨质可导致严重的并发症。JNA破坏颅底骨质进行扩张性生长的机制尚未清楚。最近在研究病理性骨质破坏性疾病中发现IFN-γ和IL-1在胆脂瘤型中耳炎骨质破坏中发挥重要作用［2-4］。JNA的骨质破坏过程与胆脂瘤的骨质破坏过程有许多相似之处，它们都是良性肿瘤，都会破坏颅底骨质进行扩张性生长。本实验拟应用免疫组化染色SP法检测IFN-γ和IL-1在JNA组织中的表达，探讨其在JNA骨质破坏机制中的作用，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料来源

20例鼻咽血管纤维瘤标本来自于2000～2012年福建医科大学附属第一医院病理科，福建省耳鼻喉研究所石蜡包埋存档蜡块。鼻咽血管纤维瘤组：鼻咽血管纤维瘤患者标本共20例，术后病理诊断均为鼻咽血管纤维瘤，患者年龄11～35岁，平均18.5岁，其中男20例，女0例。按Metin等［5］的肿瘤分期标准：Ⅰ期7例，Ⅱ期6例，Ⅲ期6例，Ⅳ期1例。对照组10例下鼻甲组织术后诊断为下鼻甲慢性炎症，患者年龄18～40岁，平均25岁，其中男5例，女5例。标本来自2015年3～6月温州医科大学附属第一医院耳鼻喉-头颈外科，在内窥镜下取鼻中隔偏曲伴下鼻甲肥大患者的下鼻甲组织。标本均是24 h内取材，应用4%甲醛固定，常规石蜡包埋，4μm厚连续切片。

1.2 试剂

兔抗人IFN-γ单克隆抗体购自SANTA CRUZ公司和兔抗人IL-1多克隆抗体购自北京博奥森生物技术有限公司。

1.3 免疫组织化学染色

操作严格按照说明书进行，步骤如下：①烤片，68℃，20min；②常规二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水；二甲苯Ⅰ20 min-二甲苯Ⅱ20 min-100%酒精Ⅰ10 min-100%酒精Ⅱ10min-95%酒精5 min-80%酒精5 min-70%酒精5 min；③阻断灭活内源性过氧化物酶：3% H2O237℃孵育10min，PBS冲洗3×5min；④抗原修复：置0.01M枸橼酸缓冲液（pH 6.0）中煮沸（95℃，15～20min），自然冷却20min以上，再用冷水冲洗缸子，加快冷却至室温，PBS冲洗3×5 min；⑤正常羊血清工作液封闭，37℃10 min，倾去勿洗；⑥滴加一抗4℃冰箱孵育过夜，PBS冲洗3×5min（用PBS缓冲液代替一抗作阴性对照）；滴加生物素标记二抗，37℃孵育30 min，PBS冲洗3×5min；⑦滴加辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液，37℃孵育30min，PBS冲洗3×5min；⑧DAB/H2O2反应染色，自来水充分冲洗后，苏木素复染，常规脱水，透明，干燥，封片。用PBS代替第一抗体作为阴性对照，用已知阳性片做阳性对照。

1.4 免疫组化结果判断［6］

IFN-γ和IL-1的阳性染色者细胞胞浆有棕黄色颗粒沉着，阳性细胞数：0分为无阳性细胞，1分为阳性细胞数＜25%，2分为阳性细胞数占25%～50%，3分为阳性细胞数占51%～75%，4分为阳性细胞数占＞75%。染色强度：0分为无染色，1分为弱染色，2分为中等强度染色，3分为强染色。计算各抗体的阳性细胞数和染色强度得分，以3～7分为阳性。

1.5 统计学分析

应用SPSS13.0统计学软件进行分析，IFN-γ和IL-1阳性表达率采用χ2检验或者精确概率法进行比较，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 IFN-γ和IL-1的阳性表达

主要位于JNA血管壁内皮细胞和基质成纤维细胞的胞浆中，呈棕黄色。IFN-γ和IL-1在下鼻甲组织中弱表达或无表达，弱表达颗粒主要位于成纤维细胞胞浆、血管内皮细胞的胞浆和浆液性腺体中，着色强度不一，见封三图1。分别对JNA组和下鼻甲组的IFN-γ和IL-1阳性表达率分别进行比较，见表1～2。JNA组中的IFN-γ的阳性表达率为100%（20/20），下鼻甲组中的IFN-γ阳性表达率为20%（2/10），JNA组中的IFN-γ表达水平明显高于下鼻甲组，差异有高度统计学意义（P＜0.01）。JNA组中的IL-1的阳性表达率为100%（20/20），下鼻甲组中IL-1的阳性表达率为20%（2/10），JNA组中的IL-1表达水平明显高于下鼻甲组，差异有高度统计学意义（P＜0.01）。

表1 IFN-γ蛋白在JNA组织和下鼻甲组织中的表达情况

表2 IL-1蛋白在JNA组织和下鼻甲组织中的表达情况

2.2 IFN-γ和IL-1蛋白在鼻咽血管纤维瘤的不同临床分期中的阳性表达率

本研究表明IFN-γ和IL-1在鼻咽血管纤维瘤的不同临床分期中的表达比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表3、4。

表3 IFN-γ在JNA的不同临床分期中的表达情况

表4 IL-1在JNA的不同临床分期中的表达情况

3 讨论

IFN-γ对于破骨细胞的调控有不同的观点，有研究显示［7］IFN-γ通过快速降解RANK的衔接蛋白-TRAF6来干扰细胞内RANKL信号的传导，抑制破骨细胞的形成。然而Gao等［8］报道IFN-γ会刺激破骨细胞形成，使MHC-Ⅱ抗原的表达上调，进一步刺激T细胞的活化，活化的T细胞可以产生大量的TNF-α和RANKL，这两项研究认为IFN-γ这种间接作用已经超过其对破骨细胞前体的抑制作用，进一步导致破骨细胞的形成，造成骨质破坏。Kohara H等［9］研究发现IFN-γ直接抑制破骨细胞生成和诱导细胞凋亡Fas/FasL信号提供，导致骨吸收的间接调控，这是在炎症部位对骨破坏的保护作用。金玲爽等［10］报道在胆脂瘤中耳炎患者外周血中检测IFN-γ，显示IFN-γ促进慢性中耳炎骨质破坏，其结果与马志超等［11］研究结果相似。IL-1（interleukin-1，IL-1）是一种单核因子，最主要由活化的单核-巨噬细胞产生，成纤维细胞和朗罕氏细胞也可合成和分泌IL-1。IL-1的生物学活性比较广泛，可作用于机体的各个系统。IL-1可刺激骨细胞产生前列腺素E2（PGE2），然后PGE2再刺激破骨细胞，促进骨质的破坏吸收［12］。Zhang H等［13］研究发现IL-1受体拮抗剂阻断肌源性干细胞分化为破骨细胞和骨吸收，而且IL-1α可进一步增强破骨细胞分化和骨吸收。Hienz SA等［14］研究发现肿瘤坏死因子-α、IL-1β、PGE2促进破骨细胞的活性，特别是在出现炎症时如发现牙周炎状态。有研究显示白细胞介素-1β是重要的促炎性细胞因子，其参与了RA的发病机制，主要引起关节炎症和关节软骨破坏［15-18］。RuscittiP等［19］研究证明白细胞介素（IL）1β是最强大的促炎细胞因子之一，是一种强刺激因素，在体外和体内通过刺激破骨细胞RANKL上调，促进骨吸收。已有研究报道，IL-1存在于胆脂瘤上皮、基质，明显表达于邻近胆脂瘤的单核细胞、骨细胞、角化的上皮细胞，于正常的外耳道皮肤也有表达，但在正常皮肤的表达明显低于胆脂瘤上皮［20］。虽然有研究证明无论有无胆脂瘤，IL-1均可导致慢性中耳炎骨质吸收。但也有研究显示，当胆脂瘤存在时，骨破坏的范围更大，程度更严重［3］。本研究结果显示，IFN-γ和IL-1蛋白在JNA中的阳性表达率均为100%，明显高于IFN-γ和IL-1蛋白在下鼻甲组织中的阳性表达率20%，两者间有明显的统计学差异。但是本研究中IFN-γ和IL-1在鼻咽血管纤维瘤的不同临床分期中的表达比较，差异无统计学意义（P＞0.05），表明IFN-γ和IL-1蛋白与鼻咽血管纤维瘤的扩张性生长无显著相关。我们推测IL-1刺激成骨细胞产生前列腺素E2、IL-6可刺激破骨细胞前体细胞的分化，而前列腺素E2和IL-6又可刺激骨吸收，导致骨质破坏。IFN-γ可能刺激破骨细胞形成，使MHC-Ⅱ抗原的表达上调，进一步刺激T细胞的活化，活化的T细胞可以产生大量的TNF-α和RANKL，IFN-γ这种促进作用形成破骨细胞，导致骨质破坏。本研究认为IL-1和TNF-γ在JNA骨质破坏中可能参与两种主要病理过程：①刺激成骨细胞产生前列腺素等炎症介质；②通过刺激破骨细胞，减少糖蛋白合成，增加糖蛋白降解，并产生胶原酶和其他中性蛋白酶，释放骨钙等，从而导致骨质的破坏。IFN-γ和IL-1虽然与鼻咽血管纤维瘤的扩张性生长无显著相关，但IFN-γ和IL-1蛋白在JNA组织中有较高的阳性表达率，我们推测其可能是参与JNA骨质破坏的影响因素，其具体机制有待进一步研究。

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Expression and significance of interferon-γand interleukin-1 in juvenile nasopharyngeal angiofibroma

WU Xianmin1WU Peng1YE Fan1LIZhichun2YANG Kaiyan3LIN Chang2CHEN Xiaoyun1
1.Department of Otorhinolaryngology and Head and Neck Surgery，the First Affiliated Hospital ofWenzhou Medical U-niversity，Wenzhou 325000，China；2.Department of Otorhinolaryngology and Head and Neck Surgery，the First Affiliated Hospital of Fujian Medical University，Fuzhou 350004，China；3.Departmentof Pathology，the First Affiliated HospitalofWenzhou Medical University，Wenzhou 325000，China

Objective To investigate the expression of interferon-γand interleukin-1 in human juvenile nasopharyngeal angiofibroma tissues.M ethods Twenty juvenile nasopharyngeal angiofibroma samples collected from 2000 to 2012 and ten normal inferior turbinatemueosa specimens collected from March to June 2015 were enrolled in this study，and expressions of IFN-γand IL-1 were determined by immunohistochemistry.Results The positive rate of IFN-γand IL-1 proteins all was 100%in JNA，obviously higher than that in normal inferior turbinatemueosa which the positive rate was20%（P＜0.05）.The expression of IFN-γand IL-1 protein had no relationship with clinic staging of JNA（P＞0.05）. Conclusion This study reveals that the positive rate of IFN-γand IL-1 are markedly increased in the juvenile nasopharyngeal angiofibroma and are closely related to bone resorption induced by juvenile nasopharyngeal angiofibroma.

Interferon-γ；Interleukin-1；Juvenile nasopharyngeal angiofibroma；Immunohistochemistry

R739.63

A

1673-9701（2016）18-0001-03

2016-03-10）

浙江省温州市公益性科技计划项目（Y20140596）

▲通讯作者