获得性中耳胆脂瘤基础研究进展

吴华东 熊园平 江红群

南昌大学第一附属医院耳鼻咽喉头颈外科(南昌330006)

获得性中耳胆脂瘤是耳鼻咽喉科较为常见的一种慢性中耳疾病，非真性肿瘤，其角质形成细胞的异常增殖和迁移可导致邻近组织结构的侵蚀，轻者可造成外耳、中耳结构破坏、听力下降、面瘫等并发症；严重者病变可侵及内耳甚至颅内，造成如眩晕、硬膜外脓肿、脑脓肿等严重并发症，甚至死亡。中耳胆脂瘤在组织学上表现为角蛋白碎片和复层鳞状上皮的混合体,主要由3种成分构成：基质旁组织、上皮基质和含大量角蛋白碎片的囊性内容物。手术是目前获得性胆脂瘤的唯一有效治疗方法，但胆脂瘤手术后仍有复发的可能性。目前胆脂瘤的发病机制暂不明确，主流的发病机制学说有：袋状内陷理论、上皮迁移理论、鳞状化生理论和基底细胞增生理论。但这些理论学说尚无法完全解释胆脂瘤的过度增殖、迁移、分化改变、侵袭性和复发性的临床特性，因此深入了解胆脂瘤发病的分子机制和危险因素，以降低甚至解除疾病的发生、发展及复发，甚至寻找可行的非手术治疗方案，成为了目前研究热点。本文就获得性中耳胆脂瘤相关基础研究进展进行综述。

1 细胞因子与获得性胆脂瘤

获得性胆脂瘤几乎都存在于感染和炎症环境中，复杂环境下产生的细胞因子对胆脂瘤的发生、发展起重要作用，研究表明胆脂瘤组织中高表达的磷酸化表皮生长因子受体（Phosphorylated epidermal growth factor receptor，pEGFR）参与了胆脂瘤的形成和发展[1，2]。Liu等人的研究发现pEGFR，磷酸化蛋白激酶B（protein kinase B，p-Akt）、细胞周期蛋白D1（cyclinD1）和增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）在胆脂瘤组织中都呈现为高表达，且p-EGFR、p-Akt、cyclinD1的表达与PCNA的表达呈显著正相关。随后他们建立了人外耳道角质形成细胞（External auditory canal keratinocytes，EACKs）模型，发现表皮生长因子（Epidermal growth factor，EGF）可显著促进EACKs的增殖，且可引起CyclinD1表达的上调。而EGFR抑制剂AG1478和磷脂酰肌醇-3-激酶（Phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）抑制剂 Wortmannin对EGF诱导的EACKs增殖有明显的抑制作用。由此他们推断EGF通过激活EGFR/PI3K/Akt/CyclinD1信号通路，参与了胆脂瘤上皮的过度增殖[2]。另一项研究发现肝素结合型表皮生长因子样生长因子（heparin-binding EGF-like growth factor，HB-EGF）相比外耳道正常皮肤组织在胆脂瘤中也呈高表达，且与胆脂瘤骨破坏程度呈正相关，提示HB-EGF可能参与了胆脂瘤上皮角质形成细胞的增殖和胆脂瘤骨破坏机制[3]，但其中的确切通路与机制仍需进一步实验探讨。

中耳胆脂瘤上皮细胞的过度增殖还与角质细胞生长因子（Keratinocyte growth factor，KGF）有关，Yamamoto-Fukuda等人通过在动物模型中耳内长期重复转染KGF cDNA，成功诱导了中耳胆脂瘤的发生[4]。KGF还可能通过诱导pp63的表达，促进胆脂瘤干细胞和/或祖细胞的增殖活性、抑制胆脂瘤基底层祖细胞的分化，从而引起胆脂瘤上皮的增生[5]。胆脂瘤组织中的角质形成细胞还可分泌甲状旁腺激素相关蛋白(Parathyroid hormone associated protein，PTHrP)，并通过核因子-κB受体活化因子配体（Receptor Activator of Nuclear Factor-κB Ligand，RANKL）信号通路参与中耳胆脂瘤的骨吸收过程[6]。血管生成生长因子，如成纤维细胞生长因子α（Fibroblast growth factor，FGF-α）、转化生长因子-β（Transforming growth factor-β，TGF-β）、转化生长因子-α（Transforming growth factor-α，TGF-α）和血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF），则与胆脂瘤基质周围血管生成密切相关，这些细胞因子在支持角质形成细胞持续迁移到鼓室的过程中起着至关重要作用，参与胆脂瘤的扩张[7]。

此外，Mzczepanski等人发现胆脂瘤组织中胞内高表达的高迁移率族蛋白B1（high-mobility box 1，HMGB1）在应激或坏死时可从胞内释放出来，与角质形成细胞中过度表达的晚期糖基化终产物受体（Receptor for Advanced Glycation Endproduct，RAGE）结合，导致角质形成细胞增殖、迁移和白细胞介素（Interleukin,IL）-8的分泌，参与胆脂瘤的形成和骨破坏[8]。随后Chi等人在胆脂瘤上皮细胞外检测到了HMGB1和凋亡胆脂瘤角质细胞释放的DNA片段，发现当它们同时存在时可显著诱导胆脂瘤角质形成细胞产生肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor，TNF-α）和IL-1b，导致胆脂瘤的骨吸收和破坏[9]。这些研究表明，细胞因子在胆脂瘤的生物学行为中有着重要作用，与胆脂瘤进展和骨破坏密切相关。

2 感染和获得性胆脂瘤

获得性胆脂瘤常常与病原体的感染相生相伴，当感染发生时与人非特异性免疫有关的病原体识别受体(Pathogen recognition receptor，PRR)可通过识别病原体表达的病原体相关分子模式,诱导一系列免疫反应的发生，从而参与胆脂瘤的发生、发展。研究发现PRR家族中Toll样受体4（Toll-like receptors 4,TLR4）在获得性胆脂瘤中表达增加且与疾病严重程度呈正相关。构建的小鼠动物模型发现，与野生型小鼠对比，缺乏TLR4表达基因的小鼠IL-1β、TNF-α、NF-κB和RANKL和抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP）mRNA表达水平降低，从而减少了体内破骨细胞的形成，减轻了对实验性获得性胆脂瘤所致的骨破坏和听力损失[10]。与TLRs类似，髓系细胞触发受体(triggering receptors expressed on myeloid cells，TREM)是与炎症反应相关的受体家族，研究发现TREM-2在获得性胆脂瘤组织中表达明显升高，其表达水平与胆脂瘤的骨破坏程度呈正相关。而敲除小鼠的TREM-2基因可减轻实验获得性胆脂瘤的成熟以及胆脂瘤引起的骨破坏。这项研究认为，TREM-2可能是通过激活TLR-4信号通路放大炎症反应、促进金属基质蛋白酶（Matrix metallo proteinases,MMPs）的分泌以及激活胆脂瘤组织中的破骨细胞三个方面参与胆脂瘤的发生发展。然而这项研究对TREM-2激活TRL-4信号通路的证据不够充分，仍需要更有说服力的实验证明[11]。MMP-2和MMP-9是一组能降解细胞外基质的蛋白水解酶,研究表明MMP-2和MMP-9在胆脂瘤组织中表达明显高于正常皮肤组织，与胆脂瘤的发生、发展及骨质破坏有关[12]。另外一项研究提示Rho激酶可能在细胞分化中起重要作用,其活性降低和表达减弱可能导致了角质形成细胞过度增殖和低分化[13]。

胆脂瘤的持续性和复发性临床特点与胆脂瘤标本中广泛存在细菌生物膜有关。因局部或全身应用的抗生素难以清除中耳生物膜内的固着的细菌，在某种情况下，这些生物膜内的固着细菌可重新游离，引起疾病的迁延不愈和复发。目前越来越多的证据发现生物膜广泛存在于胆脂瘤标本中，支持了生物膜与胆脂瘤之间的联系[14]。对胆脂瘤感染中的微生物种类研究发现，最常见的病原菌为铜绿假单胞菌[15]，Si等人将小鼠自体皮片移植入中耳腔再向中耳腔内注入铜绿假单胞菌，6周后92%的实验动物发生了胆脂瘤[16]。诱导性胆脂瘤沙土鼠模型中，伴随铜绿假单胞菌感染的动物与未感染组相比，前者胆脂瘤的大小和侵袭性增加[17]，这些研究都表明胆脂瘤与铜绿假单胞菌感染存在密切联系。最近一项对胆脂瘤和正常中耳微生物区系的基因测序技术研究显示，胆脂瘤基质和胆脂瘤附近未累及的粘膜中存在着多种微生物的感染[18]，因此获得性胆脂瘤的发生发展可能是多种微生物感染共同导致的结果，但目前通过微生物感染种类对获得性胆脂瘤发病机制的研究较少，仍需进一步探寻。

3 基因组学改变与获得性胆脂瘤

与正常皮肤相比，胆脂瘤组织中有多种细胞增殖标记物表达上调，如细胞角蛋（Cytokeratin，CK）16、Ki67、PCNA等，证明了胆脂瘤上皮具有高增殖活性。Lin等人报道了中耳胆脂瘤细胞中β-链蛋白(β-catenin)的表达显著增加，激活Wnt/β-catenin通路，可诱导CK16、CK18、Ki67和增殖细胞核抗原的表达，促进胆脂瘤上皮细胞增殖[19]。全基因微阵列分析发现，和正常外耳道皮肤对比，胆脂瘤中有811个基因上调，334个基因下调。多种在肿瘤中下 调 的 抑 癌 基 因 ，如 ：CDH18.19、ID4、PAX3、LAMC2、TRAF2B等在胆脂瘤中也下调。在炎症中起重要作用的KRT6B、SPP1和S100A7A显著上调。CK5/6、CK14以及MMPs、PAX3、SP5、TFAP2B等转录因子在胆脂瘤中下调[20]。另一项对胆脂瘤组织DNA差异表达分析发现，其中有104个基因表达上调，178个基因表达下调，其囊括了受体结合、细胞通讯与运动、维生素代谢、细胞因子介导炎症等各个方面，实时PCR技术证实了其中部分关键基因：TCN1、PI3、IL-8、IGF-2、KLKI3、HSP90B、ARGE基因上调，而DCD、CCL27基因下调[21]。这些上调或下调的基因都可作为未来研究的重要方向。细胞型Fas相关死亡域蛋白样白介素-1B转换酶抑制蛋白（c-FLIP）是一种凋亡抑制蛋白，可使细胞凋亡受抑制，常常在人类恶性肿瘤和良性增生性上皮疾病中高表达，Chung等人在胆脂瘤中也发现了c-FLIP的高表达，且与细胞增殖标记物KI-67的高表达具有显著正相关性，提示细胞凋亡和抗凋亡间的平衡性的改变在胆脂瘤的发病机制中起一定作用[22]。

总而言之，对获得性胆脂瘤基因组的研究表明有许多分子调节网络参与了疾病的发生，这些调节节点在未来可能成为药物治疗的靶点。

4 micro-RNA与获得性胆脂瘤

micro-RNA是一种长度约20-24个核苷酸的非编码单链RNA分子，在控制细胞功能，包括细胞分化、增殖和凋亡方面发挥重要作用。Zang等人发现miR-203a在胆脂瘤组织中表达下调，其下调导致了其直接靶基因转录因子Bmil的上调，Bmi1可促进角质形成细胞的增殖，防止胆脂瘤细胞过早衰老和死亡，此外，Bmi1还可增强p-Akt的表达，通过这两种作用机制从而促进了胆脂瘤上皮细胞的生长、增殖[23]。MiR-21因在多种癌症组织中高表达而广为人知，其可通过抑制抑癌基因的表达而导致细胞的异常增殖，常被认为是一种致癌miRNA；let-7miRNA在许多实体器官肿瘤中表达下调，并通过靶向癌基因发挥肿瘤抑制作用。Chen和Qin等人发现胆脂瘤组织中的miR-21和let-7amiRNA的表达水平明显高于正常皮肤，且这种现象在儿童胆脂瘤中尤为明显，他们的研究认为胆脂瘤中高表达的let-7miRNA可能通过抑制HMGA2的表达，导致角质形成细胞凋亡增加和胆脂瘤细胞增殖减少，miR-21的上调则导致了胆脂瘤的高增殖和侵袭性特点，因此胆脂瘤的高增值但却表现为良性的性质是由于let-7a microRNA和miR-21之间的动态平衡所致，但这一点仍有待完全确定[24]。随后Zhang等人发现let-7a模拟物的过表达抑制了miR-21的表达。相反，抑制let-7a可促进miR-21的表达。证实了microRNA let-7a可通过使角质形成细胞周期阻滞于G0/G1期从而抑制其增殖和诱导其凋亡两种机制抑制胆脂瘤的生长，且let-7a还可抑制胆脂瘤角质形成细胞的迁移和侵袭[25]。在随后的研究中他们进一步发现抑制miR-21也可促进let-7a miRNAs的表达，表明miR-21和let-7a miRNAs之间还存在除下游靶点以外的相互调节机制[26]。最近Xie等人利用miRNA微阵列技术比较了获得性中耳胆脂瘤和正常皮肤的miRNA表达谱[27]，发现胆脂瘤组织中共有44个上调的miRNA(miRNA-21-3p、miRNA-584-5p、miRNA-16-1-3p等)和175个下调的 miRNA(miRNA-10a-5p、miRNA-152-5p、miRNA-203b-5p等)。血管生成在胆脂瘤的扩张中作用也必不可少[6]，在人胆脂瘤周围成纤维细胞分泌的外泌体中，miR-106b-5p表达的下调，对邻近内皮细胞中血管紧张素II的抑制作用减弱，以此促进胆脂瘤新生血管形成，从而调节胆脂瘤的发展[28]。

5 获得性胆脂瘤中的干细胞

Nagel等人首次报道了在胆脂瘤组织中发现干细胞群体：中耳胆脂瘤干细胞（Middle Ear Cholesteatoma derived Stem Cells,ME-CSC）。它们具有自我更新、形成神经球和分化为中胚层和外胚层细胞型的能力。相比健康外耳道皮肤来源的干细胞，ME-CSC具有更高的TLR4表达和对炎症刺激的敏感性。将其置于模拟胆脂瘤的微环境中还能够分化为角质形成细胞样细胞。随后，进一步对比MECSC和外耳道皮肤干细胞，发现ME-CSC的TLR4的表达显着增加的同时，伴随着TNF-α，IL-1α，IL-1ß，IL-6和IL-8的脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）依赖性促炎基因表达显着增强。与TNFα处理的外耳道皮肤干细胞相比，用TNFα刺激ME-CSC导致IL-6，IL-8以及TNFα本身的表达水平显着提高。他们认为这是由于ME-CSCs中存在一个由TNF-α驱动NF-κB从而激活的放大炎症的正反馈循环[29]。进一步实验中发现TLR4拮抗剂LPS-RS可使MECSC的IL-1ß，IL-6和TNFα表达几乎完全丧失，从而阻断ME-CSCs对炎症的放大反应[30]。这些发现表明了胆脂瘤干细胞的存在及在胆脂瘤中的作用，为胆脂瘤的临床治疗提供了可能的干预方向。

6 结论与展望

本文对获得性胆脂瘤的基础研究进行了较为全面的总结和综述，但其具体发病机制仍需进一步研究和阐明，目前对胆脂瘤的基础研究更进一步提示了炎症介质、局部感染、基因组学改变和胆脂瘤干细胞与胆脂瘤的生物学行为密切相关。这些研究结果，为我们后续胆脂瘤的干预和治疗提供了理论基础。