星毛冠盖藤中总黄酮超声乙醇浸提工艺的优化

谢金攀　谢裕安　杨　帆　毛赛兰　广西医科大学附属肿瘤医院　530021　南宁市河堤路71号梁琼平　金秀瑶族自治县瑶医医院　545708庞赵生　金秀瑶族自治县瑶医药研究所　545708



星毛冠盖藤中总黄酮超声乙醇浸提工艺的优化

谢金攀谢裕安杨帆毛赛兰广西医科大学附属肿瘤医院530021南宁市河堤路71号
梁琼平金秀瑶族自治县瑶医医院545708
庞赵生金秀瑶族自治县瑶医药研究所545708

摘要目的：优选星毛冠盖藤中总黄酮的超声乙醇浸提工艺。方法：以料液比、乙醇体积分数、超声处理时间、浸泡时间为考察因素，以总黄酮含量为评价指标，以正交试验优选星毛冠盖藤中总黄酮的提取工艺。结果：优选出的最佳提取工艺为：在40℃水浴，超声功率100 W的条件下，加入20倍量65%乙醇，室温下浸泡星毛冠盖藤3 h，超声提取50 min。结论：所选工艺合理、可行，可用于星毛冠盖藤中总黄酮的提取。

关键词星毛冠盖藤；总黄酮；超声提取；正交试验

星毛冠盖藤（Pileostegia tomentella Hand.-Mazz.）为虎耳草科冠盖藤属植物，分布于湖南、广东、广西等省，具有祛风除湿、散瘀止痛、消肿解毒功能，主治腰腿酸痛、风湿麻木、跌打损伤、骨折、外伤出血、痈肿疮毒［1］。其同属植物冠盖藤（Pileostegia viburnoides Hook.f.et Thoms.）具有抗肿瘤、抗炎镇痛等多种药理活性［2-3］。目前有关星毛冠盖藤的药理研究尚无文献报道，实验证实，星毛冠盖藤中含有黄酮类化合物［4］，而黄酮类化合物具有抗氧化、抗肿瘤、抗病毒、调节免疫、防治血管硬化等功能［5］。超声提取因其能缩短提取时间、效率高、溶剂用量少、低温不破坏有效成分等优点，广泛用于天然物质的提取。本实验优选星毛冠盖藤中总黄酮的超声乙醇浸提工艺，为后续的开发利用提供科学依据。现报道如下。

1　实验材料

1.1仪器AL204电子天平［梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司］；TU-1810紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；KQ-100VDE型双频数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，最大功率：100 W，频率：28/45 kHz）。

1.2药材星毛冠盖藤茎和枝，2014年7月采于广西金秀瑶族自治县，经广西壮族自治区药用植物研究所鉴定为星毛冠盖藤，烘干，粉碎，过40目筛，备用。

1.3试剂芦丁对照品（上海彩佑实业有限公司，批号为KB140211，纯度≥98%）；无水乙醇（分析纯，天津市富宇精细化工有限公司）；氯化铝（分析纯，台山市粤侨试剂塑料有限公司）。

2　方法与结果

2.1星毛冠盖藤中总黄酮的含量测定

2.1.1对照品溶液的制备精密称取芦丁对照品6.0 mg，置25 ml容量瓶中，加适量60%乙醇溶解并定容，摇匀，得0.24 mg/ml的对照品溶液，备用。

2.1.2供试品溶液的制备精密称取星毛冠盖藤粉末10.0 g，置250 ml具塞玻璃锥形瓶中，超声提取前无预浸泡处理，加入60%乙醇200 ml，在40℃水浴（用仪器的水浴加热功能和流动水控制温度），超声功率100 W的条件下，28/45 kHz（每5秒转换频率1次）超声提取40 min。用相应浓度乙醇补足重量，摇匀，抽滤，取续滤液，放冷至室温，作为供试品溶液。

2.1.3反应试剂的添加精密吸取一定量待测溶液，加入25 ml容量瓶中，再精密加入0.1 mol/L AlCl3溶液1.0 ml，反应40 min后，加60%乙醇定容至刻度。供试品溶液与AlCl3溶液反应会产生少量的白色絮状沉淀，定容前过滤。

2.1.4最佳吸收波长的选择以试剂为空白，取适量对照品溶液和供试品溶液，按“2.1.3”项下方法操作后在190～1 100 nm范围内进行光谱扫描，结果芦丁在可见光区域有唯一波峰出现于412 nm处，样品在可见光区域无吸收波峰出现，在紫外光区域芦丁与样品于270 nm有一致的波峰，故选择270 nm为最佳吸收波长。加三氯化铝后光谱扫描图见图1。

2.1.5标准曲线的测定分别精密吸取对照品溶液0 ml、1.0 ml、2.0 ml、3.0 ml、4.0 ml、5.0 ml，置25 ml容量瓶中，按“2.1.3”项下方法精密加入反应试剂，显色40 min，加60%乙醇至刻度，摇匀。以第1份为空白，在270 nm波长处测定吸光度（A）。以芦丁对照品溶液的浓度（C）为横坐标，A为纵坐标，进行线性回归，得回归方程为A= 35.732C-0.0002（R2=0.9999），芦丁对照品溶液的浓度在0～0.048 mg/ml范围内与吸光度呈良好线性关系。

2.1.6样品含量测定精密量取供试品溶液2 ml，按“2.1.3”项下方法操作，以不加供试品溶液为空白，在270 nm波长处测定吸光度，根据回归方程计算各样品中总黄酮含量。

2.2方法学考察

2.2.1精密度试验精密量取供试品溶液2 ml，按“2.1.3”项下方法操作，测定吸光度，连续测定6次。结果RSD＝0.18%（n＝6），表明仪器精密度良好。

2.2.2稳定性试验精密量取供试品溶液2 ml，按“2.1.3”项下方法操作，分别在0 h、0.5 h、1.0 h、2.5 h、3.0 h、3.5 h、4.0 h测定吸光度。结果RSD＝1.02%（n＝7），表明供试品溶液在4 h内稳定性良好。

2.2.3重复性试验精密称取星毛冠盖藤粉末10.0 g，共6份，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，再分别精密量取供试品溶液2 ml，按“2.1.3”项下方法操作，测定吸光度。结果RSD＝0.53%（n＝6），表明本方法重复性良好。

2.2.4加样回收率试验精密称取0.5 g已知总黄酮含量（2.29 mg/g）的星毛冠盖藤粉末，共18份，分别倒入50 ml具塞尖底玻璃离心瓶中，其中9份分为3组，分别精密加入7.63 ml、9.54 ml、11.45 ml的芦丁对照品溶液［6］，另外9份作为本底管［7］，超声提取前未浸泡，各加60%乙醇至20倍量、超声提取40 min，按“2.1.5”项下方法操作，测定总黄酮的含量。计算得平均加样回收率为98.85%，RSD＝1.20%（n＝9）。

2.3单因素试验

2.3.1超声功率单因素试验精密称取星毛冠盖藤粉末10.0 g，共5份，各加入15倍量55%乙醇，超声提取前未浸泡，分别在60 W、70 W、80 W、90 W、100 W超声功率下超声提取40 min，按“2.1.5”项下方法测定总黄酮含量。结果如图2所示，随超声功率的提高（100 W内）总黄酮提取率呈线性上升，故选择超声功率为100 W。

2.3.2料液比单因素试验精密称取星毛冠盖藤粉末10.0 g，共5份，分别加入5、10、15、20、25倍量55%乙醇，超声提取前未浸泡，超声提取40 min，按“2.1.5”项下方法测定总黄酮含量。结果如图3所示，用20倍量的乙醇提取得到的总黄酮含量最高。

2.3.3乙醇体积分数单因素试验精密称取星毛冠盖藤粉末10.0 g，共5份，分别加入20倍量的55%、65%、75%、85%、95%的乙醇，超声提取前未浸泡，超声提取40 min，按“2.1.5”项下方法测定总黄酮含量。结果如图4所示，在65%乙醇中提取得到的总黄酮含量最高。

图1　光谱扫描图

图2　超声功率对总黄酮含量的影响

图3　料液比对总黄酮含量的影响

图4　乙醇体积分数对总黄酮含量的影响

图5　超声提取时间对总黄酮含量的影响

2.3.4超声提取时间单因素试验精密称取星毛冠盖藤粉末10.0 g，共5份，各加入20倍量的65%乙醇超声提取，超声提取前未浸泡，超声处理时间分别为30 min、40 min、50 min、60 min、70 min，按“2.1.5”项下方法测定总黄酮含量。结果如图5所示，当提取50 min时，总黄酮的溶出已达到极限。

2.3.5浸泡时间单因素试验精密称取星毛冠盖藤粉末10.0 g，共5份，分别加入20倍量的65%乙醇室温下浸泡1 h、2 h、3 h、4 h、5 h后，超声提取50 min，按“2.1.5”项下方法测定总黄酮含量。结果如图6所示，浸泡2 h后总黄酮含量已趋于平衡。

2.4正交试验优选提取工艺根据单因素试验结果，在40℃水浴和超声功率100 W的条件下，选取浸泡时间（A）、料液比（B）、乙醇体积分数（C）、超声提取时间（D）为考察因素，以总黄酮含量为评价指标，选用L9（34）正交表进行试验，因素水平见表1。正交试验结果见表2。取离差平方和（SS）最小的因素A为误差列［8］，方差分析结果见表3。

由表2、表3的统计学分析结果可知，在考察范围内，各因素影响提取工艺的主次顺序为B＞C＞D＞A，即料液比＞乙醇体积分数＞超声提取时间＞浸泡时间，因素B、C 和D对提取工艺的影响有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。最佳提取工艺条件为A2B2C2D2，即用20倍量的65%乙醇室温下浸泡3 h后超声提取50 min。

2.5验证试验精密称取星毛冠盖藤粉末10.0 g，共3份，按上述优选的最佳提取工艺进行提取，其中3份测得总黄酮含量分别为5.921 mg/g、5.918 mg/g、5.919 mg/g，平均总黄酮含量为5.920 mg/g，高于表2中的最高值，表明所选工艺稳定、可行，可用于星毛冠盖藤中总黄酮的提取。

3　讨　论

因为高温会破坏成分，所以本研究未采用回流提取法和热水提取法。随着提取时间的增加，由于超声的热效应，水浴温度会有所升高，故本实验同时采用流动水控制水浴温度。虽然黄酮类化合物因分子中具有酚羟基而显酸性，但碱性条件下的处理和后期的酸化对成分研究均产生一定程度的干扰，因此不将溶剂的pH值作为考察因素。综上考虑，本实验在40℃水浴，以超声功率、料液比、乙醇体积分数、超声提取时间、浸泡时间为考察因素，通过单因素和正交试验，优选最佳提取工艺条件。

(4) 盾尾间隙的大小由盾构机机型和刀具布置决定，过小的盾尾间隙对于减小地表沉降有一定作用，但结合工程实际，盾尾间隙过小亦可能对盾构机掘进姿态调整带来不便。因此需通过全面考虑和权衡再来进行盾构机机型的选取[14]。

实验表明在其它条件不变时，60～100 W范围内的超声功率对星毛冠盖藤中总黄酮的提取率有所影响（图2），但100 W以上的超声功率是否更佳则有待进一步探究。同等条件下，随着料液比的增加，溶剂过多，可能是由于分散了作用于药材的超声能量，导致总黄酮的提取量更低（图3）。不同体积分数的乙醇可以提取不同极性的黄酮，高浓度的乙醇（90%～95%）适用于游离黄酮的提取，60%浓度左右的乙醇适用于黄酮苷类的提取［9］，从图4和表2结果可以推测星毛冠盖藤中总黄酮以黄酮苷类为主，而含游离黄酮较少。正交设计没有空白列时，虽然重复试验可提高试验精确度和可靠性，但明显增加了试验次数。根据专业书籍［8］，选择离差平方和中最小者作近似估计也是允许的。尽管在表3中取离差平方和（SS）最小的因素A（浸泡时间）为误差项，但从图6能够看出浸泡作为超声提取的预处理也很有必要。提取时间和浸泡时间越长，杂质也产生越多，超出一定范围，对总黄酮的提取可产生不利影响（图5、图6）。兼顾节约能源和节省时间，本实验优选最佳提取工艺条件为A2B2C2D2，即用20倍量的65%乙醇室温下浸泡3 h后超声提取50 min。根据验证试验结果，表明提取工艺合理、可行，可用于星毛冠盖藤中总黄酮的提取。

图6　浸泡时间对总黄酮含量的影响

表1　因素水平表

表2　正交试验方案安排与结果

表3　方差分析结果

参考文献

［1］赵运林，喻勋林，傅晓华.湖南药用植物资源［M］.长沙：湖南科学技术出版社，2009：446-447.

［2］潘星星.冠盖藤抗癌镇痛实验研究［D］.长沙：湖南中医药大学，2013.

［3］秦莉花，钟华美，陈晓阳，等.冠盖藤的抗炎镇痛作用［J］.中国老年学杂志，2014，34（2）：429.

［4］李咏梅，佘朋桂，肖冰梅.星毛冠盖藤不同药用部位的高效液相色谱分析［J］.中国民族民间医药，2013，22（18）：17.

［6］国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部［S］.北京：中国医药科技出版社，2010：附录130.

［7］韦丁，陈健.香菇多糖含量测定过程中加样回收率的比较［J］.食品研究与开发，2010，31（10）：155.

［8］刘文卿.实验设计［M］.北京：清华大学出版社，2005：84-86.

［9］匡海学.中药化学实验方法学［M］.北京：人民卫生出版社，2012：209-215.

（2015－12－29收稿/编辑陈明伟）

基金项目：广西卫生厅适宜技术研究与开发项目（编号：S201417-05）

中图分类号：R284.2

文献标识码：A

文章编号：1003-0719（2016）01-0069-05