健脾益气方含药血清对人肝癌细胞SMMC-7721增殖与侵袭能力的影响

谢金玲　卓少元　广西中医药大学　530001　南宁市明秀东路179号



健脾益气方含药血清对人肝癌细胞SMMC-7721增殖与侵袭能力的影响

谢金玲卓少元*广西中医药大学530001南宁市明秀东路179号

摘要目的：观察健脾益气方含药血清对人肝癌细胞SMMC-7721增殖与侵袭能力的影响。方法：以TGF-β1诱导人肝癌细胞SMMC-7721上皮-间质转化（EMT）模型，制备健脾益气方大鼠含药血清，分别以0%、5%、10%、15%、20%、30%含药血清浓度干预人肝癌细胞SMMC-7721 12 h、24 h、48 h、72 h后，采用四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法检测细胞的增殖能力，采用Transwell细胞体外侵袭实验观察细胞的侵袭能力。结果：健脾益气方对SMMC-7721 EMT细胞的增殖有抑制作用，且随含药血清浓度增高而递增，呈时间依赖性；12 h 10%含药血清，24 h 15%、20%、30%含药血清，48 h 15%含药血清与相对应浓度空白血清比较，均具有显著性差异（P< 0.01），其中以48 h 15%含药血清浓度对细胞增殖的抑制效果最明显。健脾益气方含药血清各个浓度组与对照组相比，细胞侵袭能力均有不同程度的下降，其中10%、15%、20%、30%浓度的含药血清都具有显著性差异（P< 0.01）；而与空白血清组相比，15%、20%、30%浓度的含药血清均具有显著性差异（P<0.01），其中以15%浓度的含药血清对细胞侵袭的抑制作用最明显。结论：15%健脾益气方含药血清作用48 h，对人肝癌细胞SMMC-7721 EMT模型增殖与侵袭的抑制效果最好。

关键词健脾益气方；SMMC-7721；上皮-间质转化；MTT；Transwell

Effects of medicated serum containing Jianpi Yiqi decoction on proliferation and invasion of hepatic carcinoma cells SMMC-7721

Xie Jin ling Zhuo Shao yuan*
Guangxi University of Chinese Medicine，NO.179，Mingxiu Dong Rd，Nanning，530001

Abstract Objective:To observe effects of medicated serum containing Jianpi Yiqi decoction on proliferation and invasion of hepatic carcinoma cells SMMC-7721.Methods:The epithelial-mesenchymal transition（EMT）model of hepatic carcinoma cells was induced by TGF-β1to make medicated serum containing Jianpi Yiqi decoction.After 12 h,24 h,48 h,72 h,TGF-β1-induced SMMC-7721 cells were interfered with medicated serum with the concentration of 0%，5%，10%，15%，20%，30%，respectively.The proliferation effect on SMMC-7721 was measured by MTT colorimetric assay and the invasion ability was observed by Transwell invasion assay in vitro.Results:Jianpi Yiqi decoction had inhibitory effect on proliferation for SMMC-7721 EMT cell,which strengthened with the increase of concentration of medicated serum and exhibited time-dependence.Compared with the corresponding blank serum,the inhibition effect of medicated serum with the concentration of 10%on cell proliferation had significant difference at 12 hours（P<0.01）,as well as the medicated serum with the concentration of 15%，20%，30%at 24 hours,and 15%at 48 hours.The medicated serum with the concentration of 15%had the most obvious inhibition effect on cell proliferation at 48 hours.The invasive ability of SMMC-7721 cells was significantly decreased to varying degree after treatment with different concentrations of medicated serum compared with that of control group.The medicated serum with the concentration of 10%，15%，20%，and 30%had significant difference（P<0.01）.Compared with the corresponding blank serum,medicated serum with the concentration of 15%,20%,30%had statistic significance（P<0.01）.The medicated serum with the concentration of 15%had the most obvious inhibition effect on cell invasion.Conclusion:The medicated serum with the concentration of 15%at 48 hours has the best inhibition effect on proliferation and invasion of SMMC-7721 EMT model of hepatic carcinoma cells.

Keywords Jianpi Yiqi decoction；SMMC-7721；EMT；MTT；Transwell

健脾益气是中医临床防治肝癌的重要治法。本课题组前期研究发现，经健脾益气方治疗的二乙基亚硝胺（DEN）诱导肝癌大鼠，在提高肝癌大鼠生存率的同时，其肝（含肝癌）组织基因组转录水平呈现明显的规律性改变［1］。为进一步阐明健脾益气方治疗肝癌的作用机理，本实验采用TGF-β1诱导的人肝癌细胞SMMC-7721上皮-间质转化（EMT）模型，结合血清药理学方法，通过四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法和Transwell细胞体外侵袭实验观察健脾益气方不同浓度含药血清对人肝癌细胞增殖与侵袭能力的影响，以筛选出合适的含药血清浓度及最佳的作用时间，为后续研究奠定基础。

1　实验材料

1.1动物健康雄性SD大鼠30只，体重200±20 g，购自广西医科大学实验动物中心，合格证号：SCXK2009-0002。

1.2人肝癌细胞株人肝癌细胞SMMC-7721，购自中南大学高等研究中心细胞室。

1.3药物与试剂健脾益气方采用免煎中药配方，药用：白术10 g，薏苡仁15 g，黄芪30 g，白芍15 g，神曲10 g，云茯苓15 g，法半夏10 g。免煎中药为江阴天江药业有限公司产品，购于广西中医药大学附属瑞康医院。高糖DMEM、胰蛋白酶（Tryprin）、胎牛血清（FBS），均为美国Wisent公司产品；四甲基偶氮唑盐（MTT）试剂盒为Vazyme公司产品；TGF-β1为美国Peprotech公司产品；二甲基亚砜（DMSO）为Sigma公司产品。

1.4主要仪器细胞培养箱（Sanyo，日本）；高速离心机（Thermo Fisher Sorvall ST 16R，美国）；荧光显微镜（Olympus BX53，日本）；酶标仪（Epoch Biotek，美国）。

2　实验方法

2.1含药血清的制备将SD大鼠随机分为含药血清组和空白血清组，每组各15只。其中含药血清组给予健脾益气方灌胃，给药剂量=临床常用量×动物等剂量系数×培养液内稀释度，即动物等效剂量×培养液内稀释浓度。每日8∶00 和16∶00分别给药1次，连续3天，于末次给药后1 h采血，严格无菌操作，腹主动脉采血，血样置于5 ml采血管，静置2 h以上，待血块收缩良好后，3 000 r/min，15 min无菌分离血清，血清以55℃处理30 min，用0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，分装后置-80℃保存备用。空白血清组大鼠给予生理盐水灌胃，其空白血清制备方法同含药血清组。

2.2人肝癌细胞SMMC-7721 EMT模型制备参照文献［2-3］，取常规培养的人肝癌细胞株SMMC-7721于对数生长期接种在96孔板中，待贴壁后，吸去培养孔中的培养液，分别用0 ng/ml、5 ng/ml、10 ng/ml、20 ng/ml浓度的TGF-β1处理SMMC-7721细胞12 h、24 h、48 h，采用四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法和Transwell细胞体外侵袭实验观察细胞的增殖侵袭能力，选择最佳诱导浓度和最佳作用时间（后续实验以此作为诱导EMT模型的条件），同时采用HE（苏木精-伊红）染色法观察SMMC-7721 EMT模型细胞形态。

2.3MTT法检测细胞增殖抑制率取对数生长期的人肝癌细胞SMMC-7721（已诱导为EMT模型，下同）进行细胞计数，调整细胞浓度为4×104/ml，以每孔100 μl接种于96孔培养板中，设置对照组（培养基不加药，有细胞）、不同浓度的健脾益气方含药血清组及相对应的空白血清组，每组设定5个复孔。细胞常规培养24 h后对实验孔细胞进行相应血清干预。经12 h、24 h、48 h后，每孔分别加入10 μl MTT溶液（5 mg/ml），孵育4 h，小心吸弃上清，每孔再加入100 μl DMSO。酶标仪测定各孔细胞OD值（λ＝570 nm），取偏差较小的3个数值，按下列公式计算不同浓度含药血清对细胞的增殖抑制率（IR）：抑制率（%）=［1-（实验组OD值/对照组OD值）］×100%。

2.4Transwell侵袭实验取无血清培养基按照基质胶∶培养基体积比1∶4稀释，并混匀，往Transwell上室加入稀释后的基质胶，每孔加入50 μl，均匀铺平，置于培养箱孵育3～4 h。每个上室加入100 μl的细胞悬液（浓度2×104个/100 μl），下室加入600 μl 10%FBS培养液，置培养箱中孵育24 h；用4%多聚甲醛固定细胞20 min，0.1%结晶紫染色15 min；于高倍显微镜下随机选取5个视野，计数穿过小室的细胞数，取其平均值，进行统计学分析。

2.5统计学方法实验数据采用SPSS17.0统计软件分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，各均数两两比较采用q检验，以α=0.05作为检验水准。

3　结　果

3.1TGF-β1诱导SMMC-7721 EMT模型的最佳浓度和作用时间见表1、表2。

表1　TGF-β1对SMMC-7721细胞增殖能力的影响（±s，n=5）

表1　TGF-β1对SMMC-7721细胞增殖能力的影响（±s，n=5）

注：与同时间段的对照组（0 ng/ml）比较，①P<0.01，②P<0.05；与同浓度TGF-β1干预12 h比较，③P<0.01

浓度梯度（ng/ml）0 OD值12 h　24 h　48 h 0.741±0.025②　1.290±0.092③　1.617±0.122①③10　0.754±0.029②　1.171±0.096③　1.427±0.169②③20　0.606±0.049①　0.877±0.048①③　1.184±0.052③0.819±0.019　1.181±0.077　1.121±0.189 5

表2　TGF-β1对SMMC-7721细胞侵袭能力的影响（±s，n=5）

表2　TGF-β1对SMMC-7721细胞侵袭能力的影响（±s，n=5）

注：与同时间段的对照组（0 ng/ml）比较，①P<0.01；与同浓度TGF-β1干预12 h比较，②P<0.01

浓度梯度（ng/ml）0侵袭细胞数（个）12 h　24 h　48 h 95.3±3.5　113.7±3.5①②　125.3±6.8①②10　105.7±3.8　182.3±5.9①②　208.0±7.6①②20　104.0±5.6　111.0±7.9　136.3±5.5①②92.3±6.8　97.3±4.5　107.3±3.1 5

实验结果显示：采用不同浓度（0 ng/ml、5 ng/ml、10 ng/ml、20 ng/ml）的TGF-β1干预不同时间（12 h、24 h、48 h）后，MTT分析（表1）发现除0 ng/ml外，5 ng/ml、10 ng/ml、20 ng/ml的TGF-β1均有促进细胞增殖的作用，且呈时间依赖性，但增殖能力20 ng/ml<10 ng/ml<5 ng/ml，20 ng/ml的TGF-β1干预24 h与干预12 h比较有明显的抑制作用（P<0.01）；增殖效果最明显的为5ng/mlTGF-β1干预48h和10ng/ml TGF-β1干预48 h，此两种浓度TGF-β1干预48 h的作用与同时间段的对照组比较有显著性差异（P<0.05）；与同浓度TGF-β1干预12 h比较有显著性差异（P<0.01）。Transwell分析（表2）发现不同浓度的TGF-β1干预SMMC-7721细胞，细胞的侵袭均呈时间依赖性；侵袭能力最明显为10 ng/ml TGF-β1干预24 h和48 h，其细胞侵袭数目远高于其它组别（P<0.01）。因此，TGF-β1诱导人肝癌细胞SMMC-7721发生上皮-间质转化（EMT）的最佳浓度为10 ng/ml，最佳干预时间为48 h。

图1　对照组SMMC-7721（×400）

图2　模型组SMMC-7721（×400）

3.2HE染色法观察SMMC-7721 EMT模型细胞形态10 ng/ml TGF-β1干预SMMC-7721 48 h后制得EMT模型。HE染色结果显示，对照组细胞贴壁生长良好，荧光显微镜下可见上皮样形态，卵圆形、多角形或星形等不规则形态；模型组细胞数目明显增多，细胞多呈长梭形，细胞核增大。见图1、图2。

3.3健脾益气方含药血清对SMMC-7721 EMT模型细胞增殖的抑制效果见表3。

表3结果显示，健脾益气方含药血清各浓度组OD值基本都低于同一时段同一浓度的空白血清组。健脾益气药对SMMC-7721 EMT细胞增殖的抑制作用随含药血清浓度增加而递增，且呈时间依赖性；12 h 10%含药血清，24 h 15%、20%、30%含药血清，48 h 15%含药血清浓度与相对应浓度空白血清比较，均具有显著性差异（P<0.01），但这些组别中以48 h 15%含药血清浓度对细胞增殖的抑制效果最明显。

3.4健脾益气方含药血清对SMMC-7721 EMT模型细胞侵袭的抑制效果见表4。

表4结果显示，健脾益气方含药血清各浓度组与对照组相比较，细胞侵袭能力均有不同程度的下降，其中10%、15%、20%、30%浓度的含药血清均具有显著的抑制细胞侵袭的作用（P<0.01）；而与空白血清组相比，15%、20%、30%浓度的含药血清均具有显著的抑制细胞侵袭的作用（P<0.01），但其中以15%浓度的含药血清对细胞侵袭的抑制作用最明显，它与其它含药血清浓度组相比也具有显著性差异（P<0.01）。

4　讨　论

上皮-间质转化（Epithelialmesenchymal transition，EMT）在肝癌的发生、发展及侵袭转移过程中发挥着关键作用［4-5］。SMMC-7721是一种基本无转移、典型的上皮型人肝癌细胞株。因此我们在实验中首先采用TGF-β1诱导SMMC-7721发生EMT。10 ng/ml的TGF-β1干预48 h，可使SMMC-7721发生明显的EMT，这与文献报道是一致的［2］。

健脾益气方是本课题组对临床中医药防治肝癌文献分析［6］后归纳总结出来的抑癌扶正行气活血法的亚治法拆方，对应临床肝癌脾气虚弱的基本证型。方中以黄芪为君，白术、云茯苓为臣，白芍、半夏、薏苡仁、神曲为佐，意在补益正气、健脾祛湿、散结消痞。不同浓度的健脾益气方含药血清对SMMC-7721 EMT模型的增殖和侵袭均有不同程度的抑制作用，其中以15%含药血清浓度作用48 h对细胞的抑制效果最明显，在后续实验中，可以此作为合适的含药血清浓度及最佳的作用时间开展进一步的研究。

表3　健脾益气方含药血清对SMMC-7721 EMT模型细胞增殖的抑制效果　　（±s，n=5）

表3　健脾益气方含药血清对SMMC-7721 EMT模型细胞增殖的抑制效果　　（±s，n=5）

注：与同时间段相对应浓度的空白血清组比较，①P<0.01

组别　　浓度抑制率（%）12 h　24 h　48 h　12 h　24 h　48 h　72 h OD值72 h对照组　　—　0.570±0.003　0.681±0.013　0.826±0.048　-　-　-　-1.172±0.300空白血清组5%　0.498±0.043　0.611±0.028　0.676±0.027　12.52　10.28　18.19　54.91 10%　0.564±0.023　0.623±0.014　0.621±0.005　0.94　8.42　24.89　51.89 15%　0.497±0.052　0.647±0.020　0.561±0.008　12.76　5.00　32.15　48.51 20%　0.458±0.045　0.587±0.009　0.504±0.046　19.54　13.76　39.01　46.54 0.528±0.012 0.564±0.004 0.603±0.017 0.626±0.043 30%　0.283±0.024　0.594±0.002　0.429±0.025　50.26　12.78　48.12　46.32 0.629±0.017含药血清组5%　0.517±0.031　0.578±0.017　0.654±0.012　9.25　15.08　20.90　54.88 10%　0.473±0.004①　0.606±0.030　0.609±0.019　16.91　10.97　26.26　52.66 15%　0.482±0.013　0.539±0.028①　0.428±0.008①　15.33　20.86　48.20　52.12 20%　0.348±0.011　0.497±0.009①　0.368±0.033　38.91　27.03　55.47　50.90 30%　0.264±0.005　0.504±0.016①　0.300±0.041　53.66　26.00　63.70　52.29 0.529±0.013 0.555±0.019 0.561±0.039 0.575±0.019 0.559±0.002

表4　健脾益气方含药血清对SMMC-7721 EMT模型细胞侵袭的抑制效果　（±s，n=5）

表4　健脾益气方含药血清对SMMC-7721 EMT模型细胞侵袭的抑制效果　（±s，n=5）

注：与对照组比较，①P<0.01；与空白血清组比较，②P<0.01；与15%含药血清组比较，③P<0.01

细胞侵袭数390.8±6.0 385.0±4.5 384.8±4.0③377.8±7.4①③356.8±4.4①②373.0±4.0①②③366.8±5.2①②③组别　　浓度对照组　　—空白血清组　　—5% 10%含药血清组　15% 20% 30%

参考文献

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［2］Xu Z，Shen M X，Ma D Z，et al.TGF-beta1-promoted epithelial-to-mesenchymal transformation and cell adhesion contribute to TGF-beta1-enhanced cell migration in SMMC-7721 cells［J］.Cell Res，2003，13（5）：343-350.

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［6］陈德溯，方肇勤.中药治疗原发性肝癌中晚期的药味频率分析［J］.辽宁中医杂志，2002，29（4）：187-189.

（2015－12－18收稿/编辑陈明伟）

*通信作者，E-mail：sherwin_zhuo@126.com

基金项目：广西自然科学基金项目（编号：2014GXNSFBA118145）

中图分类号：R285.5

文献标识码：A

文章编号：1003-0719（2016）01-0062-04