小肠类器官培养技术的建立和优化*



小肠类器官培养技术的建立和优化*

宋东娟#童锦禄&冉志华郑青&

上海交通大学医学院附属仁济医院消化内科上海市消化疾病研究所

上海市炎症性肠病研究中心(200001)

背景：小肠类器官是体外研究肠道上皮最好的工具，应用前景广泛，然而目前国内尚无相关研究报道。目的：在国内建立并优化小肠类器官培养技术，为小肠上皮细胞的基础研究提供平台。方法：常规培养L-WRN细胞，收集含不同浓度胎牛血清(FBS)的条件培养基。处死6~8周龄C57BL/6小鼠，自末端回肠起取约15 cm肠段，纵向剖开，EDTA法分离、收集隐窝上皮，以基质胶包埋多聚化后加入不同浓度梯度的L-WRN条件培养基，显微镜下动态观察出芽情况，待出芽达一定长度后，重新包埋传代培养。结果：与含20% FBS的L-WRN条件培养基相比，含10% FBS的条件培养基更有利于小肠类器官的体外培养。条件培养基浓度为10%、15%、20%、25%、30%均可促使小肠类器官形成，15%条件培养基的出芽率最高。结论：本研究在国内首次成功建立了小肠类器官培养技术，并发现15% L-WRN条件培养基(含10% FBS)更有利于小肠类器官出芽。

关键词小肠类器官；原代细胞培养；L-WRN细胞；培养基，条件性；隐窝；干细胞

Establishment and Optimization of Culture Technique for Enteroids

SONGDongjuan,TONGJinlu,RANZhihua,ZHENGQing.DivisionofGastroenterologyandHepatology,RenJiHospital,SchoolofMedicine,ShanghaiJiaoTongUniversity;ShanghaiInstituteofDigestiveDisease;ShanghaiInflammatoryBowelDiseaseResearchCenter,Shanghai(200001)

Co-correspondence to: TONG Jinlu, Email: tongjinlu490@126.com; ZHENG Qing, Email: qingzheng101@163.com

Background: Enteroids are considered to be the best tool for studies on intestinal epitheliuminvitroand have a widely application prospects, however, there are no associated reports in China. Aims: To establish and optimize the culture technique for enteroids and provide a fantastic platform for the basic research of small intestinal epithelial cells in China. Methods: L-WRN cells were cultured routinely and the conditioned medium with different concentrations of fetal bovine serum (FBS) was collected. Six to eight weeks old C57BL/6 mice were sacrificed and 15 cm small intestine from the terminal ileum was removed and cut longitudinally. Crypts were digested with EDTA and then collected and embedded in Matrigel®Matrix; after polymerization of Matrigel®Matrix, L-WRN conditioned medium at different concentration gradient was added. The budding ratio and length of buds were measured dynamically under microscope. The enteroids were re-embedded for subculture when certain length of buds was reached. Results: Compared with L-WRN conditioned medium containing 20% FBS, the conditioned medium containing 10% FBS was more favorable for enteroids cultureinvitro. When conditioned medium accounted for 10%, 15%, 20%, 25% or 30% of the mixed medium, they all promoted the growth of enteroids and the 15% one seemed to yield better result. Conclusions: An enteroids culture technique was successfully established for the first time in China. When the L-WRN conditioned medium containing 10% FBS accounts for 15% of the mixed medium, it might promote budding better than the others.

Key wordsEnteroids;Primary Cell Culture;L-WRN Cells;Culture Media, Conditioned;Crypts;

Stem Cells

肠道上皮由隐窝和绒毛单元组成，具有快速自我更新能力，其中隐窝为增殖区域，包括小肠干细胞及其子代细胞，绒毛则是由各种终末分化细胞组成的分化区域。相对于转化细胞和肿瘤细胞株，小肠类器官(enteroids)是目前体外研究肠道上皮最好的工具，应用前景广泛。既往已有众多国内外学者探讨了肠上皮细胞的原代培养问题，然而均无法做到长期体外培养以及维持原代细胞的分化能力[1]。2009年，荷兰科学家Hans Clevers的团队成功地在体外将Lgr5+肠道干细胞培养成包括隐窝样区域和绒毛样上皮区域的三维结构[2]，即小肠类器官，这一结构包含所有终末分化细胞类型，能准确模拟肠道上皮生理情况，然而目前国内尚无相关研究报道。本研究旨在在国内建立小肠类器官培养技术，同时优化培养所需的条件培养基，以期为小肠上皮细胞的基础研究提供平台。

材料与方法

一、实验动物、细胞和主要试剂

C57BL/6小鼠，6~8周龄，雌雄不限，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司；L-WRN细胞由芝加哥大学惠赠。

无谷氨酰胺高糖DMEM、Advanced DMEM/F-12、青霉素10 000 U/mL-链霉素10 000 μg/mL、胎牛血清(FBS)、L-谷氨酰胺(200 mmol/L)、羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液(HEPES)、胰酶、N-2 Supplement、无维生素A型B-27®Supplement(GibcoTM, Thermo Fisher Scientific Inc.)；G418二硫酸盐50 mg/mL(Sigma-Aldrich Co. LLC.)；潮霉素B 100 mg/mL(InvivoGen.)；PBS(HyClone, GE Healthcare)；EDTA 0.5 mol/L(碧云天生物技术有限公司)；基质胶(Corning®Matrigel®Matrix, Corning Incorporated)；表皮生长因子(EGF)(PeproTech)；Jagged-1(Ana-Spec, Inc.)；Y-27632(Cayman Chemical)。

L-WRN细胞培养基：将青-链霉素(1%)和FBS(10%)加入至无谷氨酰胺高糖DMEM培养基；初始培养基：将青-链霉素(1%)、L-谷氨酰胺(1%)和FBS(10%或20%)加入至Advanced DMEM/F-12培养基；基础培养基：将青-链霉素(1%)、L-谷氨酰胺(1%)和HEPES(1%)加入至Advanced DMEM/F-12培养基。

二、实验方法

1. L-WRN条件培养基的收集：常规复苏L-WRN细胞，置于含G418(500 μg/mL)和潮霉素B(500 μg/mL)的L-WRN细胞培养基中培养；细胞数量合适时传代至75 cm2培养瓶，待细胞长满后传代至150 cm2培养瓶，此次传代无需添加G418和潮霉素B。将150 cm2培养瓶置于培养箱内培养，待细胞长满后，每瓶添加25 mL初始培养基(含10%或20% FBS)，培养 24 h 后收集培养液至50 mL离心管中，同时在培养瓶中添加新的初始培养基(含10%或20% FBS)。所收集的培养液 2 000×g离心5 min，上清液转入肖特瓶，置于4 ℃冰箱中。连续收集第1、2、3、4天的培养液，混匀后以500 mL抽滤瓶过滤，分装，-80 ℃冰箱保存。

2. 小肠隐窝的分离、培养：腹腔麻醉后以颈椎脱臼法处死小鼠，剖腹，自末端回肠起取约15 cm肠段，置于盛有冰PBS的培养皿中，以钝头剪刀纵向剖开，冰PBS反复漂洗去除粪便。将肠段肠腔面朝上平铺于玻片，刮去黏液和绒毛，用刀片切成1~2 mm 的小块。将组织块转入含10 mL冰PBS的50 mL 离心管中，上下颠倒离心管，静置待组织块沉降后负压吸弃上层液体，重复上述过程数次，直至上清液清亮。将组织块重悬于25 mL 2.5 mmol/L冰EDTA-PBS混合液中，置于摇床旋转30 min。上清液转入新的50 mL离心管中，加入冰PBS上下颠倒离心管，静置后将上清液转入离心管，重复此步骤3次，以70 μm细胞过滤器过滤收集的上清液。过滤后的上清液4 ℃ 300×g离心5 min，弃上清液，以青-链霉素(1%)-PBS 重悬沉淀，4 ℃ 300×g离心5 min，弃上清液，以10 mL基础培养基重悬沉淀，4 ℃ 300×g离心5 min。根据沉淀量加入适当体积的基础培养基重悬沉淀，取200 μL隐窝-基础培养基混合液与400 μL基质胶混匀，取出在培养箱中预热的12孔板，于每孔中央滴加50 μL隐窝-基质胶混合液，加样完毕后立即将培养板置入培养箱中1 h，使基质胶多聚化成半球形。多聚化后每孔加入1 mL不同比例的L-WRN条件培养基与基础培养基混合液以及N-2 Supplement(1%)、无维生素A型B-27®Supplement(2%)、EGF(50 ng/mL)、Jagged-1(1 μmol/L)和Y-27632(10 μmol/L)，将培养板重新置入培养箱中，每隔1 d更换培养基混合液和生长因子。培养过程中显微镜下动态观察形态学改变，培养7 d左右出芽达一定长度后，重新包埋传代培养。

结果

一、L-WRN条件培养基血清含量对小肠类器官生长的影响

分别收集FBS含量为10%和20%的L-WRN条件培养基，将条件培养基与基础培养基按1∶3、1∶1、3∶1、1∶0的比例混合，培养结果显示，无论是含10%还是20% FBS的条件培养基，与基础培养基的比例为1∶3(即条件培养基浓度为25%)时，均可培养出小肠类器官；而使用浓度为50%(1∶1)、75%(3∶1)、100%(1∶0)的条件培养基最终仅形成类球体(spheroids)。与含20% FBS的L-WRN条件培养基相比，含10% FBS的条件培养基出芽率更高，更有利于小肠类器官的体外培养(图1)。

二、15% L-WRN条件培养基的小肠类器官出芽率较高

为探索最佳培养条件，进一步将含10% FBS L-WRN条件培养基与基础培养基的比例细分为1∶9(10%)、3∶17(15%)、1∶4(20%)、1∶3(25%)和 3∶7(30%)，结果显示5种比例均可促使小肠类器官形成，15%条件培养基的出芽率最高(图2)。

三、小肠隐窝培养体系的建立

单个小肠隐窝通过持续分裂形成隐窝-绒毛三维结构，由衬有绒毛样上皮的囊样中心结构与周围隐窝样芽泡状结构组成(图3e)。分离的小肠隐窝培养1~2 h后闭合成圆形(图3a)，2~3 d后开始出芽(图3b、3c)，经过大量出芽(图3d)，最终形成小肠类器官。

含10%和20% FBS的L-WRN条件培养基分别按1∶3、1∶1、3∶1、1∶0的比例与基础培养基混合，小肠隐窝包埋在基质胶中(培养第6天，比例尺：1 mm)

图1L-WRN条件培养基血清含量对小肠类器官生长的影响

10%、15%、20%、25%、30% L-WRN条件培养基(含10% FBS)，小肠隐窝包埋在基质胶中(培养第5天，比例尺：1 mm)

图2不同浓度L-WRN条件培养基出芽率比较

图3　小肠隐窝培养过程中的形态学改变(箭头所示为出芽结构，比例尺：1 mm)

小肠干细胞位于隐窝底部，分布于Paneth细胞间，在自我更新的同时产生短暂扩充细胞(transit amplifying cells, TA细胞)，后者在快速分裂并向上迁移的同时分化为肠上皮细胞等吸收型细胞以及Paneth细胞、肠内分泌细胞、杯状细胞等分泌型细胞，其中Paneth细胞转向下迁移至隐窝底部，另三种细胞在向上迁移过程中逐渐成熟，到达绒毛顶端后凋亡脱落入肠腔[3]。

小肠干细胞处于特定的微环境中，该微环境能提供Wnt、Notch、EGF、骨形态生成蛋白(BMP)等信号以维持干细胞的自我更新、增殖和分化。Wnt信号在小肠隐窝-绒毛轴中呈梯度递减，高Wnt信号的隐窝对应于小肠干细胞区域以及增殖细胞所在部位；Wnt配体与干细胞表面的Frizzled-LRP5/6受体结合使β-catenin的稳定性增加，β-catenin聚集并进入细胞核，与转录因子Tcf结合，激活Wnt通路下游靶基因转录，从而驱动干细胞和TA细胞增殖[4]。Notch信号为维持细胞未分化状态所必需，Notch受体 与DLL1/4配体结合导致Notch胞内结构域(NICD)释放并与转录因子RBP-J结合，抑制分泌型细胞分化相关基因转录，从而促进吸收型细胞分化；如阻断小肠干细胞和TA细胞的Notch信号，这些细胞将分化为分泌型细胞如杯状细胞[5]。EGF通过其受体(EGFR)激活Ras-Raf-MEK-ERK信号通路，促进干细胞和TA细胞增殖，与Wnt信号通路具有协同作用[6]。BMP信号沿小肠隐窝-绒毛轴呈梯度递增，其与干细胞表面的受体(BMPR)结合后激活细胞内Smad1/5/8-Smad4复合体，从而抑制干细胞自我更新和增殖，限制小肠干细胞过度激活[7]，对Wnt信号通路具有拮抗作用；同时，BMP信号在分泌型细胞的终末分化中亦发挥重要作用[8]。

基于Lgr5标记肠道干细胞的发现和对小肠干细胞微环境的深入认识，Sato等[2]应用含EGF、R-spondin、Noggin等的培养基和基质胶，将Lgr5标记的肠道干细胞在体外成功培养为隐窝-绒毛样三维结构，这一结构包含特定组织来源的所有终末分化细胞，在形态和细胞组成上与体内肠道极为相似。R-spondin是Lgr5的生理性配体，研究[9]发现经R-spondin-1和Wnt3a刺激后，Lgr5与Wnt共受体LRP6-Frizzled5形成复合物，该复合物进入细胞内后即被降解，从而增强Wnt/β-catenin信号。Noggin则是BMP信号抑制剂，小鼠小肠特异性过表达Noggin时，垂直于隐窝-绒毛轴会出现大量异位隐窝单元[10]。隐窝底部基质成分富含层黏连蛋白，离开正常细胞外基质环境的肠道细胞会发生失巢凋亡[11]，而Matrigel®基质胶是一种模拟基底层富含层黏连蛋白和胶原环境的3D基质，支持肠道上皮的三维生长[12-13]。

目前国外小肠类器官的培养技术有两种：一种是在培养基中直接加入各种明确的化学物质，另一种是收集L-WRN细胞的条件培养基用于类器官培养。生长因子价格昂贵，培养成本极高，因此利用条件培养基进行培养更具优势。L-WRN细胞来源于小鼠L细胞，系通过进一步修饰L-Wnt3a而得到，可分泌Wnt3a、R-spondin-3和Noggin[14]。相对于由明确化学物质组成的重组培养基，L-WRN条件培养基成本较低，且能提供相对完整的高滴度蛋白质，激活Wnt信号通路的能力强。既往研究[15]发现，连续培养L-WRN细胞12 d，条件培养基活性不变。本研究分别使用含10%和20% FBS的初始培养基培养L-WRN细胞，连续收集前4 天的条件培养基，并在条件培养基与基础培养基混合液中加入Y-27632，Y-27632是Rho相关丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(ROCK)家族的小分子特异性抑制剂，可阻止干细胞凋亡[16]。

本研究发现，无论是含10% FBS还是20% FBS的L-WRN条件培养基，其与基础培养基的比例为1∶3(条件培养基浓度25%)时方可观察到小肠类器官生长，条件培养基浓度为50%、75%、100%时只能形成类球体，与Miyoshi等[15]的研究结果一致。此外，本研究还发现，与含20% FBS的L-WRN条件培养基相比，含10% FBS的条件培养基出芽率相对较高，故将含10% FBS条件培养基的浓度梯度设置为10%、15%、20%、25%、30%作进一步研究，发现5种浓度的条件培养基均可促使小肠类器官形成，但浓度为15%时更有利于小肠类器官出芽。

类器官包含所有特化的组织细胞类型，能模拟体内器官的某些功能，不仅可作为有效的实验工具，用于研究器官发生、发展以及药物疗效和毒性，还可通过诱导突变以及利用某种疾病患者来源的多能干细胞研究疾病的发生、发展[17]。本研究在国内首次成功建立了小肠类器官培养技术，是国内相关领域研究工作的开端，后续将基于该平台作更多有益的探索。

参考文献

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(2015-12-23收稿)

*基金项目：国家自然科学基金(81401437，81170362，81370508)

DOI:10.3969/j.issn.1008-7125.2016.02.003

#Email: 1092948274@qq.com

&本文共同通信作者，童锦禄，Email: tongjinlu490@126.com；郑青，Email: qingzheng101@163.com