以离子液体为流动相添加剂高效液相色谱法分离钩藤药材中的钩藤碱和异钩藤碱

田 玲，姚 成，边 敏

(南京工业大学 化学与分子工程学院，江苏 南京 211800)

以离子液体为流动相添加剂高效液相色谱法分离钩藤药材中的钩藤碱和异钩藤碱

田 玲，姚 成，边 敏*

(南京工业大学 化学与分子工程学院，江苏 南京 211800)

以常用流动相添加剂三乙胺作为对照，建立了以离子液体为流动相添加剂,分离钩藤药材中钩藤碱和异钩藤碱的高效液相色谱方法。以分离度及相关色谱参数为指标，选择了离子液体中咪唑阳离子烷基链长度及阴离子的种类。并分别考察了咪唑阳离子烷基链长度、离子液体浓度、流动相pH值和流动相比例对钩藤碱和异钩藤碱分离的影响，初步探讨了离子液体的分离机理。结果显示，咪唑阳离子的烷基链越长，阴离子的离子液体序列越高，分离效果越好，即[HMIM][BF4]为最优的流动相添加剂。当[HMIM][BF4]浓度为16 mmol/L，流动相pH值为3.0，甲醇比例为37%时，钩藤碱和异钩藤碱能够实现基线分离，满足样品分离测定的需求。

离子液体；流动相添加剂；高效液相色谱；钩藤碱；异钩藤碱

钩藤(Miq.ex.Havil,别名钩丁、吊藤、倒挂刺)为茜草科植物钩藤、大叶钩藤、毛钩藤或者无柄果钩藤的干燥带钩茎枝[1]。钩藤的有效成分为吲哚类生物碱，其中以钩藤碱(Rhynchophylline，RIN)[2-3]和异钩藤碱(Isorhynchophylline，IRN)[4]为主(图1)，具有降血压、抗心律失常、抗血小板聚集和抗血栓形成作用[5]。钩藤及其制剂质量评价多以钩藤总生物碱或者钩藤碱含量作为指标。测定钩藤中生物碱含量的传统方法为薄层色谱法，随着现代分析技术的进步,高效液相色谱[6-8]技术已成为中药中有效成分检测最精确有效的手段，已有报道较多以三乙胺[9]作为流动相添加剂分离钩藤药材中的钩藤碱和异钩藤碱，但实际应用效果并不理想。本课题组前期的研究表明，以室温离子液体(Room temperature ionic liquids,RTILs)为流动相添加剂分离生物碱可获得良好的分离效果[10-11]，故本研究考察了以离子液体作流动相添加剂分离钩藤碱和异钩藤碱的色谱条件，通过考察离子液体的浓度、流动相pH值和比例等因素对分离的影响，对色谱条件进行了优化。同时根据相关的色谱参数，对分离机理进行了初步探讨。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Shimadzu高效液相色谱系统：配LC-10AT泵，SPD-10A检测器，Class-VP色谱工作站。100 μL微量进样器(上海光正医疗仪器有限公司)，PHS-2C精密酸度计(上海大普仪器有限公司)。BSA124S分析天平(感量0.1 mg，德国Sartorius公司)，超声波清洗机(洁康超声波设备有限公司)。

钩藤碱和异钩藤碱标准品(纯度≥98%，Aladdin公司)，钩藤对照药材(上海源叶生物科技有限公司)；离子液体：1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐([EMIM][BF4])、1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐([BMIM][BF4])、1-丁基-3-甲基咪唑氯盐([BMIM][Cl])，纯度均大于97%，购自Aladdin公司；1-己基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐([HMIM][BF4])、1-己基-3-甲基咪唑氯盐([HMIM][Cl])，纯度均大于98%，购自Mackun公司。甲醇(色谱纯，Tedia公司)，磷酸(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)，磷酸二氢钾(KH2PO4，含量≥99.5%，上海凌峰化学试剂有限公司)，十二水合磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O，含量≥99.0%，西陇化工股份有限公司)，实验用水为娃哈哈纯净水。

1.2 标准溶液的配制

分别精密称取钩藤碱和异钩藤碱适量，置于10 mL容量瓶中，甲醇溶解稀释至刻度，摇匀，即得钩藤碱1.27 mg/mL，异钩藤碱1.08 mg/mL的标准混合液。标准混合液保存于4 ℃冰箱内，使用时放至室温，过0.45 μm滤膜即可。

1.3 样品前处理

取钩藤对照药材0.5 g，精密称定，置于锥形瓶中，加入60%甲醇15 mL，称重，超声提取30 min，冷却后，用60%甲醇补足减失重量，摇匀，过滤，取续滤液，过0.45 μm微孔滤膜。

1.4 色谱条件

InertSustain C18色谱柱：ODS柱(4.6 mm×150 mm,5 μm)。流动相：甲醇-16 mmol/L Na2HPO4溶液，用H3PO4和KH2PO4调至pH 3.0，流速：1.0 mL/min，等度洗脱。检测波长：245 nm。柱温：25 ℃。

另向流动相分别加入16 mmol/L [EMIM][BF4]，[BMIM][BF4]，[HMIM][BF4]，[BMIM][Cl]，[HMIM][Cl]和80 mmol/L三乙胺(TEA)作为添加剂。

2 结果与讨论

2.1 离子液体与三乙胺的比较

作为流动相添加剂，三乙胺[12-13]被广泛用于测定药材中的碱性组分，故本研究分别以三乙胺和离子液体作为流动相添加剂，考察其分离效果。结果显示，与无添加剂相比，三乙胺的加入大大提高了峰的对称性，分离度及柱效符合测定要求。当加入离子液体[HMIM][BF4]作为流动相添加剂时，分离时间明显缩短，且峰形好、柱效高，分离效果更佳。故本实验以离子液体作为首选的流动相添加剂应用于钩藤碱的分离测定研究。

2.2 咪唑阳离子烷基链对钩藤碱和异钩藤碱分离的影响

离子液体由于构成的阴阳离子不同，种类及性质也有所不同。本研究考察了不同阴离子及阳离子烷基链的离子液体对分离效果的影响，结果见图2与表1。

IonicliquidRetentionfactor(k)IRNRINResolutionAsymmetryfactor(As)IRNRIN[HMIM][BF4]5.056.372.271.631.06[BMIM][BF4]8.9911.281.901.811.84[EMIM][BF4]8.079.751.721.911.57[HMIM][Cl]4.335.361.731.681.56[BMIM][Cl]8.3910.311.531.721.95

结果表明，当阳离子烷基链上的碳原子个数由4增加至6时，保留时间减少，分离效率提高，且峰的对称性有所改善。故咪唑阳离子选择为[HMIM]+。而在阴离子的选择实验中，分别比较了不同离子液体序列的[BF4]-和[Cl]-的分离效果[14]，结果表明离子液体序列较高的[BF4]-的分离效果明显优于[Cl]-，且峰的对称性提高。故选择的阴离子为[BF4]-。综上所述，选择[HMIM][BF4]作为分离钩藤碱和异钩藤碱的流动相添加剂。

根据前期研究[15]，初步分析咪唑阳离子烷基链的长度影响色谱保留因子的原因主要是由于咪唑阳离子通过特殊的静电作用与分析化合物争夺固定相表面的活性吸附点，同时掩蔽了残余硅羟基对极性化合物的吸附，减弱了生物碱在反相柱的拖尾。而这种非特异性的相互作用和疏水作用，主要源于固定相的非极性烷基与咪唑阳离子的不同烷基基团相互作用。因此当以烷基基团的离子液体作为流动相添加剂时，烷基链越长，疏水性越大，咪唑阳离子与固定相的作用增强，从而减弱了分析化合物在固定相的保留值，改善了色谱峰形。所以当阳离子烷基链的长度增加，不仅可缩短保留时间，还能有效改善峰形。

此外，不同阴离子对钩藤碱和异钩藤碱的分离影响也不同。离液序列高的阴离子(如[BF4]-)[14]倾向于与溶质阳离子形成具有较强疏水性的离子对，利于反相柱固定相的吸附，从而改善峰形，提高了分离效率。

2.3 [HMIM][BF4]浓度对标准品分离的影响

以不同浓度(0,4,8,12,16,20 mmol/L)的[HMIM][BF4]为流动相添加剂，测定钩藤碱与异钩藤碱的保留因子，以考察离子液体浓度对色谱行为的影响。结果表明当[HMIM][BF4]的浓度为4 mmol/L时，钩藤碱和异钩藤碱的保留因子k急剧下降。随着添加浓度的增加，两种生物碱的保留因子k随之增加。当[HMIM][BF4]的浓度大于8 mmol/L之后，随着添加浓度的增加，两种生物碱的保留因子k不断减小，直至添加浓度达到16 mmol/L后趋于稳定。 推测[HMIM][BF4]浓度影响色谱保留因子k的原因主要是由于[HMIM][BF4]的阳离子通过特殊的静电作用与分析化合物在固定相表面竞争吸附，导致保留因子k急剧降低所致，随着[HMIM][BF4]浓度的持续增加，咪唑阳离子的竞争吸附作用增强，减弱了被分析组分在固定相表面的吸附，使得分析化合物的保留因子k缓慢降低[15-16]。因此本实验选择[HMIM][BF4]的最佳浓度为16 mmol/L。

2.4 流动相pH值对标准品分离的影响

由于生物碱的结构特性，导致在分离测定时的pH值成为影响分离效果的重要条件。本研究在色谱柱能够承受的pH值范围内对其影响进行考察，结果见表2。 结果表明，当pH值由4.0降至3.0时，分析化合物的保留因子k明显减小，分离度R明显增大。而当pH>4.0时，两种生物碱无法分离，原因可能是当pH值增大，生物碱解离减弱，阴离子无法与其形成疏水性离子对，导致添加剂作用减弱，分离度较差。所以选择分离钩藤碱和异钩藤碱的最适流动相pH值为3.0。

表2 在不同pH值条件下分离钩藤碱和异钩藤碱的色谱参数Table 2 Chromatographic parameters of RIN and IRN under different pH value

2.5 流动相比例对标准品分离的影响

分别配制甲醇体积分数为25%，30%，35%，37%，40%的流动相，考察了有机相比例对组分保留和分离度的影响。结果显示，随着有机相比例的增加，2组分的保留因子k明显减小，分离度R明显降低。综合考虑，选定有机相甲醇的比例为37%，此条件下，不仅保留因子k较小，且分离度良好，能够满足后续样品测定的需要。

2.6 离子液体的作用机理

根据以上结果显示，咪唑阳离子烷基链链长、阴离子种类、离子液体的浓度、流动相pH值及有机相比例均会对钩藤碱和异钩藤碱的色谱行为产生显著影响。根据离子液体的选择及pH值对色谱行为影响的考察结果，推断离子液体的作用机理可能是由于离子液体在反相高效液相色谱中的双重作用所致。一方面咪唑阳离子通过特殊的静电作用与分析化合物争夺固定相表面的活性吸附点，掩蔽了残余硅羟基对极性化合物的吸附，减弱了生物碱在反相柱的拖尾。另一方面，离子液体中的阴离子与生物碱电离的阳离子形成疏水性离子对，增强其保留特性，改善了色谱行为。两种作用根据分析物特性、离子液体结构的不同而有所差异。一般而言，被分离组分的电离程度减弱，极性较弱，则前者的竞争吸附作用为离子液体的主要作用；相反，被分析组分的碱性越强，电离程度越大，离子液体作为离子对添加剂的作用越大。两种作用均会改善被分离组分的色谱行为，增大分离度，提高柱效[17]。

2.7 实际样品的测定

为证明方法的可行性与有效性，分别采用已确定条件的[HMIM][Cl],[HMIM][BF4]和文献中常用的三乙胺作流动相添加剂，分离钩藤药材中的钩藤碱和异钩藤碱,结果见图3。

3 结 论

本研究考察了以离子液体作流动相添加剂分离钩藤药材中钩藤碱和异钩藤碱的色谱条件及影响因素，讨论了咪唑阳离子烷基链长度、离子液体的浓度、流动相pH值及流动相比例对钩藤药材中钩藤碱和异钩藤碱分离的影响，初步探讨了离子液体的分离机理，同时对离子液体和三乙胺分别作为流动相添加剂分离钩藤碱和异钩藤碱进行比较，突显了离子液体作为流动相添加剂在实际应用中的优势。初步建立了以离子液体为流动相添加剂分离钩藤药材中钩藤碱和异钩藤碱的高效液相色谱方法，为该方法的应用提供了依据和参考。

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Separation of Rhynchophylline and Isorhynchophylline in Uncaria Rhynchophylla by HPLC with Ionic Liquids as Mobile Phase Additives

TIAN Ling,YAO Cheng,BIAN Min*

(College of Chemistry and Molecular Engineering,Nanjing University of Technology,Nanjing 211800,China)

A reversed phase high performance liquid chromatographic(RP-HPLC ) method for the simultaneous determination of rhynchophylline and isorhynchophylline in Uncaria Rhynchophylla was established by using ionic liquids as a mobile phase additive.With degree of separation and other related chromatographic parameters as indicators,the length of alkyl chain length and the type of anion in ionic liquid were selected.In addition,several influence factors,including imidazolium cation alkyl chain of ioinic liquids and concentration,mobile phase pH value and flow phase ratio were investigated.The probable mechanism of the separation with ionic liquids as mobile phase additives was also explored.The results showed that the longer the alkyl chain length of the cationic,the higher the separation efficiency of the anion,and the better the separation effect,that means the[HMIM][BF4] is the optimal mobile phase additive.The experimental results showed that when the [HMIM][BF4] concentration is 16 mmol/L,the pH value of mobile phase is 3.0,and methanol ratio is 37%,baseline separations of rhynchophylline and isorhynchophylline were obtained, which could satisfy the requirements of sample separation.

ionic liquids;mobile phase additives;high performance liquid chromatography(HPLC);rhynchophylline;isorhynchophylline

2016-05-19；

2016-06-13

国家自然科学基金青年基金(21405082)

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.11.018

O657.72;TQ460.72

A

1004-4957(2016)11-1471-05

*通讯作者：边 敏，博士，讲师，研究方向：中药成分色谱分析，Tel:025-58139471，E-mail：bianmin@njtech.edu.cn