腺病毒介导TGF－β1转基因联合FTY720对大鼠同种异体肺移植缺血－再灌注损伤的保护作用

崔广晖 李玮浩 刘东雷 李宇航 梁有光 赵 松

腺病毒介导TGF－β1转基因联合FTY720对大鼠同种异体肺移植缺血－再灌注损伤的保护作用

崔广晖 李玮浩 刘东雷 李宇航 梁有光 赵 松

目的观察腺病毒介导TGF－β1转基因联合FTY720对大鼠同种异体肺移植缺血－再灌注损伤（IRI）的影响。方法 采用改良的三袖套法吻合技术建立大鼠左肺原位移植模型。以SD大鼠为供受体，随机分为假手术对照组、空白对照组、空载体对照组、TGF－β1组、FTY720组和TGF－β1＋FTY720组，每组6只。移植肺再灌注后4h，检测各项生理指标。结果 腺病毒介导TGF－β1转基因组荧光现象显著，并确定1×1010PFU TGF－β1基因腺病毒载体为较优转染浓度。肺移植再灌注后4h，与假手术对照组比较，空白对照组和空载体对照组出现典型的移植肺IRI症状，肺动脉血氧分压（PaO2）明显降低，二氧化碳分压（PaCO2）和湿／干重（W／D）比值明显升高，超氧化物歧化酶（SOD）活性明显降低，丙二醛（MDA）含量、髓过氧化物酶（MPO）活性和肿瘤坏死因子－α（TNF－α）含量明显升高。与空白对照组和空载体对照组比较，TGF－β1组、FTY720组和TGF－β1＋FTY720组移植肺组织水肿和间质炎症等病理组织学现象明显减轻，PaO2明显上升，PaCO2和W／D比值明显下降，SOD活性明显增加，MDA含量、MPO活性和TNF－α含量明显降低。其中，联合处理组病理症状表现出更为明显的减轻趋势。结论腺病毒介导TGF－β1转基因联合FTY720能有效减轻大鼠同种异体肺移植IRI。

转化生长因子－β1； FTY720； 肺移植； 缺血－再灌注； 大鼠

随着肺移植作为一种成熟的治疗方法广泛应用于临床，肺移植已成为当前公认的治疗许多终末期肺疾病的唯一有效手段。但器官移植必定伴随着缺血－再灌注损伤（ischemia－reperfusion injury，IRI）现象。IRI是指移植器官在较长时间缺血造成一定损伤后，恢复血供不但不减轻或逆转损伤，反而会加重损伤。肺移植后IRI的病理症状涉及肺泡－毛细血管屏障通透性增高、中性粒细胞渗出、间质和肺泡水肿、组织炎症和细胞死亡等。因此，开展移植肺IRI的研究仍然是肺移植领域中的重大课题。随着经验的积累和研究的深入，基因治疗技术的发展亦为防治IRI提供了新的方法。转化生长因子β1（transforming growth factor beta1，TGF－β1）属于TGF家族的一个亚家族，是一种强效细胞生长增殖调节蛋白，在免疫移植反应中扮演着重要角色，已成为近年细胞、组织和器官移植的研究热点［1］。FTY720是一种新型强效的抗移植物排斥药物，是子囊菌（冬虫夏草）的有效成分经结构改造而成［2］；作为一种人工合成的鞘氨醇结构类似物，在鼠科模型肺损伤中有着潜在的治疗性作用［3］。本实验通过大鼠肺移植模型，观察TGF－β1基因疗法联合FTY720对大鼠同种异体肺移植的影响，着重于探讨其在移植肺IRI中的保护作用。

材料与方法

一、实验试剂

HEK293细胞（人胚肾细胞）购自美国ATCC公司；5型腺病毒和编码小鼠TGF－β1基因的腺病毒重组体（AdenoVec－mTGF－β1）购自美国Invivogen公司；FTY720粉剂购自瑞士Novartis药物制剂有限公司；mTGF－β1和β－actin引物由上海博亚生物技术有限公司设计合成；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）试剂盒购自南京建成生物工程研究所；大鼠TNF－α酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒购自北京欣博盛生物科技有限公司。其他均为国产分析纯产品。

二、腺病毒质粒转染HEK293细胞及滴度扩增

接种HEK293细胞到6孔板，转染腺病毒质粒，镜下荧光观察后，用干冰甲醇浴和37℃水浴4次冻融溶解细胞。离心后获得病毒原液，－80℃保存，可用于感染新的细胞，扩增重组腺病毒颗粒。病毒滴度用半数组织培养感染量法测定。

三、动物分组及处理

供、受体均为纯种Sprague－Dawley（SD）大鼠，雄性，清洁级，体重250～300g，中国科学院上海实验动物中心提供。采用改良的三袖套法吻合技术建立大鼠左肺原位移植模型［4］，随机分为假手术对照组、空白对照组、空载体对照组、TGF－β1组、FTY720组、TGF－β1＋FTY720组，每组6只。假手术对照组：受鼠开胸后游离左肺动静脉及支气管，不行任何其他操作关胸。空白对照组：左供肺离体经肺静脉逆行灌注4℃低钾右旋糖酐糖液（low postassium dextran and glucose solution，LPDG）。空载体对照组：左供肺离体经肺静脉逆行灌注含空腺病毒载体的4℃LPDG。TGF－β1基因转染组：左供肺离体经肺静脉逆行灌注含TGF－β1基因重组腺病毒载体的4℃LPDG。FTY720组：受体鼠自术前3天开始至手术当日饲喂FTY720，剂量为3mg／kg，左供肺离体经肺静脉逆行灌注4℃LPDG。TGF－β1基因转染＋FTY720组：受体鼠自术前3天开始至手术当日管饲FTY720，剂量为3mg／kg；左供肺离体经肺静脉逆行灌注含TGF－β1基因重组腺病毒载体的4℃LPDG。处理后置入4℃LPDG，保存3h后移入受鼠。移植肺再灌注后4h，检测各生理指标。

四、选取TGF－β1腺病毒重组体最适使用浓度

获取左供肺后，TGF－β1基因转染组离体经肺静脉逆行灌注含0、5×109、1×1010或3×1010PFU腺病毒载体的4℃LPDG，4℃LPDG保存3h。制作冰冻切片，使用荧光倒置显微镜观察各组绿色荧光的携带率。每张切片随机选择5个观察视野，重复3次，计算各组荧光强度的平均值，比较各组间的转染效果。

五、检测移植肺功能

移植肺再灌注后4h，穿刺抽取腹主动脉血进行血气分析，检测移植肺动脉血氧分压（PaO2）和二氧化碳分压（PaCO2）。随后处死受体鼠取样，移植肺组织标本分成三等分，上1／3组织备测定湿／干重（W／D）比值；中1／3组织用4%多聚甲醛内浸泡固定，石蜡包埋，备Hematoxylin－Eosin（HE）染色；下1／3液氮固定3min后置入－80℃冻存，备ELISA和Western blot分析。

六、检测移植肺组织W／D比值

分别取部分左肺组织，肺上沾染的血液在取标本前用盐水冲洗除去。用滤纸吸净表面液体，以分析天平称取湿重。再置入80℃的烤箱中，48h后称取干重，计算移植肺W／D比值。

七、移植肺组织中TGF－β1mRNA水平检测

分别取部分左肺组织，加入1mL TRIzol液，提取RNA，反转录为cDNA后，进行PCR扩增反应。小鼠mTGF－β1基因上游引物：5’－CCAGATCCTG TCCAAACTAAGG－3’，下游引物：5’－CATGTTG CTCCACACTTGATTT－3’；大鼠β－actin基因上游引物：5’－ACCACAGTCCATGCCATCAC－3’，下游引物：5’－TCCACCACCCTGTTGCTGTA－3’。以β－actin为内参，进行mTGF－β1mRNA表达水平的半定量分析。

八、移植肺组织的病理组织学检查

分别取部分左肺组织，4%多聚甲醛浸泡固定，经梯度乙醇脱水，低温石蜡包埋、切片、HE染色后，显微镜下观察并摄片。

九、测定移植肺组织中SOD活性、MDA含量和MPO活性

分别取部分移植肺组织，按1：10（W／V）的比例加入4℃KCL溶液，冰上制取10%的组织匀浆。用黄嘌呤氧化酶比色定量法检测SOD活性，用硫代巴比妥酸法测定MDA含量，化学比色法测定MPO活性，严格按试剂盒说明书操作。

十、ELISA法测定移植肺组织中TNF－α的表达水平

分别取部分移植肺组织，加入粗提液（275 mmol／L氯化钠，75mmol／L氯化钾，l0mmol／L EDTA，100mmol／L L－精氨酸，2．5g／L吐温－80，冰醋酸调至pH值4．0），制取组织匀浆，冰上放置1h。以12 000r／min×10min离心，上清液分装，液氮快速冷冻后，－80℃冻存待用。采用ELSIA检测试剂盒测定各组TNF－α的表达量。

十一、统计学方法

采用SPSS 13．0统计软件进行统计学处理。所有数据采用表示，组间比较采用单因素方差分析。P＜0．05表示差异有统计学意义。

结 果

一、TGF－β1基因转染腺病毒载体浓度选择

与对照组相比，腺病毒载体转染组相对荧光值呈浓度依赖性增加（F＝8．325，P＝0．002），而1× 1010PFU或3×1010PFU浓度组相对荧光值差异不显著（F＝0．626，P＝0．078）（图1），因此本实验以1×1010PFU为使用浓度。

图1 各病毒滴度组的相对荧光值比较。与PFU浓度为0组比较，①P＜0．05。

二、移植肺功能和移植肺组织W／D比值检测结果

与假手术对照组比较，空白对照组和空载体对照组PaO2明显下降，PaCO2和W／D比值明显上升（F＝9．627，P＝0．002）；与空白对照组和空载体对照组比较，TGF－β1组、FTY720组和TGF－β1＋FTY720组PaO2明显上升，PaCO2和W／D比值明显下降（F＝5．526，P＝0．008）（图1、2）；而且联合处理组表现出更为明显的作用趋势。

图2 各组移植肺血气分析指标比较。与假手术对照组比较，①P＜0．05；与空白对照组比较，②P＜0．05。

图3 各组移植肺W／D比值比较。1：假手术对照组；2：空白对照组；3：空载体对照组；4：TGF－β1组；5：FTY720组；6：TGF－β1＋FTY720组与假手术对照组比较，①P＜0．05；与空白对照组和空载体对照组比较，②P＜0．05。

三、移植肺组织中TGF－β1mRNA表达水平

与预期结果相符，以大鼠特异性β－actin（452bp）为内参，TGF－β1组和TGF－β1＋FTY720组出现了小鼠特异性的mTGF－β1RNA扩增条带（350bp），而假手术对照组、空白对照组和空载体对照组基本不表达（图4）。此外，与单独腺病毒介导TGF－β1转基因组相比，联合作用组TGF－β1mRNA水平有所增加（F＝12．828，P＝0．001）。

图4 各组移植肺组织TGF－β1mRNA的表达水平比较。1：假手术对照组；2：空白对照组；3：空载体对照组；4：TGF－β1组；5：FTY720组；6：TGF－β1＋FTY720组。与假手术对照组比较，①P＜0．05

四、移植肺组织的病理组织学检测结果

病理切片观察显示，移植再灌注4h后，与假手术对照组比较，空白对照组和空载体对照组肉眼见移植肺弹性差，肺泡间隔明显增厚、水肿，呈较为严重的炎症细胞浸润，肺泡间质淤血肿胀明显，部分肺泡腔内有较明显的渗出；与空白对照组和空载体对照组比较，TGF－β1组、FTY720组和TGF－β1＋FTY720组病变程度较轻微，肺泡间质水肿明显减轻，炎症细胞浸润减少，肺泡腔内渗出减少；而且联合处理组病理症状的减轻效果更为显著（图5）。

五、移植肺组织中SOD、MPO、MDA和TNF－α检测结果

与假手术对照组比较，空白对照组和空载体对照组SOD活性明显降低（F＝2．436，P＝0．022），MDA含量、MPO活性和TNF－α含量明显增加（F＝4．421，P＝0．011）；与空白对照组和空载体对照组比较，TGF－β1组、FTY720组和TGF－β1＋FTY720组SOD活性明显增加（F＝6．895，P＝0．006），MDA含量、MPO活性和TNF－α含量则明显降低（F＝4．228，P＝0．025）（图5）；而且联合处理组表现出一定更为明显的作用趋势（图6）。

图5 各组移植肺组织HE染色（×200）。A：假手术对照组；B：空白对照组；C：空载体对照组；D：TGF－β1组；E：FTY720组；F：TGF－β1＋FTY720组

图6 各组移植肺组织MDA、SOD、MPO和TNF－α水平比较。与假手术对照组比较，①P＜0．05；与空白对照组和空载体对照组比较，②P＜0．05

讨 论

在临床上，肺移植的进展大大落后于其他器官，其中一个重要制约因素是肺移植后IRI。移植肺IRI一直是导致术后早期死亡、肺移植失败的主要原因之一，致死率达16%～25%［5］。因此，对移植肺IRI机制进行研究，寻找有效方法预防和减轻移植肺IRI，有着重要的临床意义。

肺组织所特有的肺泡上皮细胞及血管内皮细胞具有较高的ATP代谢系统，对缺血、缺氧较为敏感［6］。肺移植过程中，缺血、缺氧激活巨噬细胞，分泌炎症细胞因子，损伤肺血管内皮，导致肺水肿，并引起肺组织RI的病理改变；而TNF－α是肺IR过程中引起肺组织细胞损伤及炎症反应的一种重要细胞因子［7］。移植肺IRI程度常用以下指标来反映：（1）W／D比值反映肺功能损伤的程度，是由肺缺血引起肺毛细血管通透性增加和肺泡毛细血管膜破坏而导致的肺水潴留情况；（2）MPO活性间接反映肺内中性粒细胞的浸润程度；（3）MDA含量是判定氧自由基造成膜脂质过氧化损伤的指标之一。肺移植过程产生大量的氧自由基，触发脂质过氧化，产生许多中间产物及其终产物MDA。该过程引起一系列毒性细胞内连锁反应，如脂膜氧化、细胞器破坏、核酸破坏、细胞内各种酶失活，导致细胞死亡和肺组织损伤；④SOD是体内重要的抗氧化酶，间接反映机体清除氧自由基的能力。移植肺IRI过程中产生大量自由基，SOD消耗增加，更加重脂质过氧化，产生更多中间产物及终产物MDA［8］。因此，降低移植肺IRI主要从这几个方面入手，也是促进临床肺移植研究进展的必然策略。

TGF－β1是一种强大的多功能免疫抑制因子，在器官移植免疫中起重要作用。TGF－β1表达可减轻肾脏移植IRI［9］，抑制IRI引发的心脏成纤维细胞凋亡［10］。目前，普遍认为TGF－β1与移植肺IRI亦有密切关系［11，12］。FTY720能特异性作用于胸腺细胞和淋巴细胞细胞膜受体，具有抑制炎症作用［13］；作为一种新型强效移植免疫抑制剂［14］，具有减轻大鼠肝、肾、心脏IRI的作用［15－17］。本课题进一步采用腺病毒介导TGF－β1转基因和FTY720联合作用的方法对移植肺IRI保护作用进行相关研究，结果发现移植肺再灌注4h后出现典型的肺IRI的病理改变，导致低氧血症等。而单独腺病毒介导TGF－β1转基因方法和单独FTY720作用，以及两者联合处理，均能减轻大鼠同种异体肺移植IRI，升高PaO2，降低PaCO2和W／D比值，减轻移植肺组织学病理症状，增加SOD活性，降低MDA含量、MPO活性和TNF－α含量；虽然联合处理组没有表现出更为显著的差异，但是在减轻移植肺IRI损伤上表现出一定更为明显的作用趋势。

有报道称在大鼠肺移植中，腺病毒介导的转基因方法和FTY720联合使用会产生协同作用，使前者的表达持续时间和移植物存活时间显著延长［18］。本研究亦发现，FTY720作用使TGF－β1mRNA水平有所增加。这些数据均提示提高移植肺TGF－β1表达水平和术前移植受体大鼠饲喂FTY720均能降低移植肺IRI，并且二者可能具有协同作用，该机制可能与增加SOD活性，降低MDA含量、MPO活性和TNF－α含量等有关，这无疑为今后提高肺移植疗效提供了一条更为高效的可能途径。

综上所述，本研究以大鼠同种异体左肺原位移植为动物模型，以复制缺陷的5型重组腺病毒载体为介导，对移植供肺进行基因修饰，发现离体经肺静脉法转染目的基因是可行的。而且TGF－β1和FTY720预处理均能降低移植肺IRI，提高移植术后早期肺功能，两者联合处理具有更优的协同作用趋势，期望为今后减轻移植肺IRI和改善移植术后早期肺功能提供一种有效的治疗策略。但有关TGF－β1和FTY720在移植肺IRI中的协同保护机制仍需我们更深入地研究。

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Effects of adenovirus－mediated TGF－β1gene transfection combined with FTY720 administration on ischemia－reperfusion injury of rat lung allografts

Cui Guanghui，Li Weihao，Liu Donglei，Li Yuhang，Liang Youguang，Zhao Song．Department of Thoracic Surgery，The First Affiliated Hospital of Zhengzhou University，Zhengzhou 450052，China
Correspongding auther；Zhao Song，Email：13673665008＠163．com

ObjectiveTo investigate the effects of adenovirus－mediated transforming growth factor beta1（TGF－β1）gene transfection combined with FTY20administration on ischemia－reperfusion injury（IRI）of rat lung allografts．Methods By using improvedcuff－like＂vessel anastomosis technique，rat orthotopic left pulmonary allograft transplantation was successfully established．SD rats were chosen as both recipients and donors，and were randomly divided into sham operation control group，blank control group，empty adenovirus control group，TGF－β1group，FTY720group and TGF－β1＋FTY720 group，with 6rats in each group．Physiological indexes of each group were assessed 4hafter reperfusion．Results The fluorescence phenomenon accompanied with TGF－β1adenovirus－mediated gene transfection was remarkable，and 1×1010PFU was chosen as the optimal transfection concentration．Four hours after reperfusion of lung transplantation，compared with sham operation control group，the typical pathological change of IRI was found in blank control group and empty adenovirus control group，the partial pressure of oxygen（PaO2）levels were significantly reduced，partial pressure of carbon dioxide（PaCO2）levels and weight／dry（W／D）ratios were significantly increased，superoxide dismutase（SOD）activity was significantly decreased，and malondialdehyde（MDA）contents，myeloperoxidase（MOP）activity and tumor necrosis factor－α（TNF－α）contents were significantly increased．Compared with blank control group and empty adenovirus control group，the histopathological manifestations such as tissue edema and interstitial inflammation were much milder in TGF－β1group，FTY720group and TGF－β1＋FTY720group，PaO2levels were significantly higher，PaCO2levels and W／D ratios were significantly lower，SOD activity was significantly higher，and MDA contents，MPO activity and TNF－αcontents were significantly lower．The effect in combined treatment group exhibited a certain more remarkable alleviating tendency．Conclusions Adenovirus－mediated TGF－β1gene transfection combined with FTY20 administration could effectively ameliorate the IRI of rat lung allografts．

transforming growth factor beta1； FTY720； lung transplantation； ischemia reperfusion； rat

2016－02－05）

（本文编辑：周珠凤）

10．3877／cma．j．issn．2095－8773．2016．03．09

450052 郑州大学第一附属医院胸外科

赵松，Email：13673665008＠163．com

崔广晖，李玮浩，刘东雷，等．腺病毒介导TGF－β1转基因联合FTY720对大鼠同种异体肺移植缺血－再灌注损伤的保护作用［J／CD］．中华胸部外科电子杂志，2016，3（3）：170－176．