小分子天然产物酸碱水解的研究现状

陈雪洋，周倩，陈明，付桂明，5，黄婧嫣，李会晓，邹彬，万茵，*（1.南昌大学食品科学与技术国家重点实验室，江西南昌33007；2.南昌大学食品学院，江西南昌33007；3.南阳农业职业学院，河南南阳73000；.南昌大学江西医学院第一附属医院，江西南昌33007；5.南昌大学中德食品工程中心，江西南昌33007）



小分子天然产物酸碱水解的研究现状

陈雪洋1，2，3，周倩1，2，陈明4，付桂明1，2，5，黄婧嫣1，2，李会晓1，2，邹彬1，2，万茵1，2，*
（1.南昌大学食品科学与技术国家重点实验室，江西南昌330047；2.南昌大学食品学院，江西南昌330047；3.南阳农业职业学院，河南南阳473000；4.南昌大学江西医学院第一附属医院，江西南昌330047；5.南昌大学中德食品工程中心，江西南昌330047）

摘要：我国天然资源十分丰富，小分子天然产物具有多种生理活性，在医药及食品等领域得到了广泛应用。通过对近年来体外酸碱水解法在小分子天然产物的定量检测、定性分析、高活性苷元制备中的应用以及水解动力学研究现状进行归纳，为更多小分子天然产物利用体外酸碱水解进行深入探究提供了依据。

关键词：天然产物；小分子；酸碱水解；研究现状

天然产物活性成分是指从植物、动物、微生物和各种自然生物群落、森林、草原、水生生物等再生资源中提取的具有独特功能和生物活性的化合物，其中许多是人类疾病防治、强身健体的物质基础。天然产物的活性成分复杂，既包括多糖、蛋白质、多肽等大分子物质，又包括黄酮、甾体、生物碱、萜类等小分子物质。酸碱水解是天然产物研究中应用最广泛的水解方法，对天然产物的体内代谢、生物利用度和其在医药、食品及饲料行业中的应用具有重要指导意义。近年来，对小分子天然产物体外酸水解多以盐酸、磷酸盐缓冲液等为介质进行研究，碱水解则多在NaOH、KOH等溶液中进行研究。水解结束后通过使用HPLC、LC-MS/ MS、波谱分析和理化常数测定等方法分析水解产物及水解动力学，优化水解提取、储存条件，为水解产物的定性、定量检测及制备提供方法，并为天然产物生物活性构效关系及体内活性物质基础的深入研究提供参考，为后续研究提供指导意义。本文对体外酸碱水解法在小分子天然产物的定量检测、定性分析、高活性苷元制备中的应用以及水解动力学研究现状进行了归纳。

1　定量水解检测小分子天然产物或其水解产物

定量分析是天然产物的研究基础，通过对小分子天然产物及其水解物的定量分析可为其功能作用、活性结构基础、体内代谢和水解产物制备等方面的研究提供参考。

黄酮苷类化合物在生物体内的活性形式为其苷元[1-2]。鉴于以水解后的车前草黄酮苷元含量作为评价指标对车前草或其黄酮提取物进行质量控制，比以黄酮苷本身作为指标更具有现实意义，李明娟等[3]将车前草黄酮提取物经最优水解条件（5 mol/L盐酸75℃恒温水解1.5 h）处理后用HPLC检测所得主要黄酮苷元槲皮素、木犀草素、黄芩素含量，建立了水解-HPLC法测定车前草黄酮苷元含量的方法，数据较紫外分光光度法更精确。

不同来源的花色苷因糖基和是否乙酰化导致结构多样，而现有花色苷定量方法为直接检测花色苷含量，存在局限性和不准确性，李桂兰等[4]建议先在超声时间20 min、水解时间40 min、水解温度90℃、盐酸-甲醇溶液浓度2 mol/L条件下水解黑豆花色苷，然后以体积分数10 %甲酸-水溶液和乙腈为流动相，在波长520 nm下用HPLC检测花色苷3位糖苷键酸水解产生的苷元即花青素含量以确定花色苷含量，极大地简化了对花色苷的定量分析过程。

研究发现毛茛科植物白头翁Pulsatillae Radix水溶性成分有良好的抗肿瘤效果[5]，白头翁皂苷A3在体外对P388细胞有生长抑制作用[6]，白头翁总皂苷在体外亦能抑制肝癌7402细胞的增殖[7]。季秀美等[8]建立了高效液相色谱-蒸发光散射法（HPLC-ELSD）同时测定白头翁总皂苷碱水解产物中8种皂苷的定量测定方法，HPLC流动相为甲醇-0.2 %甲酸水溶液，梯度洗脱条件为0～30 min，70 %～100 %甲醇，流速1.0 mL/min，柱温35℃；ELSD气化室温度40℃，载气压力350 kPa；为白头翁总皂苷碱水解产物的质量控制提供了良好基础。

白芍主要有效成份为芍药苷、芍药内酯苷等单萜苷类，具有抗炎[9]、保肝[10]等多种活性，这一类物质被统称为白芍总苷，均具有苯甲酸酯键结构，水解后产生苯甲酸。瞿白露等[11]基于白芍总苷碱水解产生的苯甲酸在pH 2.72乙酸-乙酸钠缓冲溶液中经280 nm波长激发而发射310 nm波长光线的特点，建立了中药白芍中白芍总苷含量测定的荧光光度法，用此法测得白芍生药材中白芍总苷含量为3.12 %，中药饮片中为2.30 %，测定结果与高效液相色谱法[12]结果（生药材3.03 %，饮片2.24 %）无明显差异，为测定白芍总苷中具有相同基团和母体结构的物质含量提供了方法。

秋水仙碱是一种重要的酰胺基类生物碱，但剂量高时对人体有较强毒性[13]，因此对其快速准确定量十分重要。江珊珊等[14]研究发现秋水仙碱于0.2 mL0.2 mol/L NaOH溶液中水解10 min所得水解产物在pH 2.9～4.6的Britton-Robinson（BR）缓冲溶液中与溴酚蓝（BPB）、溴甲酚绿（BCG）、溴百里酚蓝（BTB）、百里酚蓝（TB）等酸性磺酞类染料反应形成1∶1的离子缔合物，可引起共振瑞利散射（RRS）急剧增强，并产生新的RRS光谱，建立了一种较灵敏、简便、快捷定量测定秋水仙碱的新方法，可用于痕量秋水仙碱的定量测定。

2　小分子天然产物水解动力学的研究

通过考察小分子天然产物水解动力学，可以有助于选择其适宜的储存条件、提取工艺及其在保健食品、新药开发中的进一步应用。

芍药根中的蒎烷单萜苦味苷芍药苷，具有抗炎、免疫调节[15]、抑制肿瘤[16]、抗抑郁[17]等方面的作用。刘倩等[18]根据试验结果推测芍药苷的水解符合一级动力学模型，在酸性条件下水解速率更快，这对于中药及复方中芍药苷的提取具有一定的指导意义。

洋地黄类强心苷杠柳毒苷是传统中药香加皮中主要的有效强心成分[19]。冯红等[20]报道杠柳毒苷的水解过程符合一级动力学，水解速率不受杠柳毒苷初始浓度的影响，而与温度和pH相关性较大。

丹参的主要水溶性成分丹酚酸B在抗氧化[21]、保护心脑血管缺血再灌注损伤[22]等方面有较强的生物活性。Guo等[23]试验发现丹酚酸B水解符合一级动力学，且水解速率依赖于pH，在pH 2时最稳定。试验结果有助于确定丹酚酸B储存及提取的最佳温度和pH。

开环异落叶松树脂酚二葡萄糖苷（SDG）是亚麻籽中含量最高的木酚素，具有弱激素/抗雌激素双向调节功能，也是一种良好的抗氧化剂[24]。Yuan等[25]研究发现亚麻籽SDG在弱碱性条件下的水解符合一级动力学，碱的浓度对其水解活化能有很大影响，而低浓度NaOH条件下温度对其水解影响最大（例如NaOH浓度为3 mmol/L～4 mmol/L时，温度越低，SDG低聚物完全水解所需时间越长）。

人参皂苷R0不稳定[26]，其结构中的酯苷键在碱性条件下易水解。朱琼等[27]比较了不同温度（40℃～100℃）及pH（8.01～13.01）对人参皂苷R0水解的影响，研究发现其水解符合一级动力学，水解速率与水解温度及pH呈正相关，同等温度下，pH越大水解越迅速，同等pH下则是温度越高水解越迅速，表明强碱或高温下人参皂苷R0更易发生水解，但是当pH达到13，水解温度过高时，其发生非水解反应机制的降解。

3　小分子天然产物水解产物的定性研究

小分子天然产物具有多种生理活性，通过对小分子天然产物的水解产物的定性来研究其构效关系及其在体内活性的物质基础已成为一种常用手段。

山茶种子中的皂苷类成分具有抗过敏[28]、抗高血脂[29]等作用。为深入研究山茶皂苷类化合物的构效关系，李宁等[30]将茶种总皂苷用1 mol/L氢氧化钾溶液室温水解4 h，利用反复制备型反相HPLC法分离纯化后得到5种碱水解产物，通过理化常数和波谱分析鉴定为5个去酰基茶皂苷类化合物。

远志皂苷属齐墩果烷型五环三萜，其碱水解产物具有抗老年性痴呆等作用，为确定远志皂苷碱水解产物的物质基础，王君等[31]将远志皂苷加入pH14的NaOH溶液中水解4 h，分离确定了碱水解产物中细叶远志皂苷、3，4，5-三甲氧基肉桂酸、肉桂酸、黄花倒水莲皂苷A和对甲氧基肉桂酸等主要化学成分，其中后两种为首次从碱水解产物中分离。

姜状三七皂苷R1具有细胞毒性[32]，然而其降糖作用可能优于人参皂苷R0[33]，但其主要来源姜状三七药材稀少，朱琼等[27]将人参皂苷R0在pH 13.01、70℃下水解后，经分离鉴定其碱水解产物为姜状三七皂苷R1，为进一步研究姜状三七皂苷R1提供了新来源途径。

人参与不同中药配伍，所得煎煮液的pH会有变化，煎煮液中人参皂苷的溶出和种类也会随之改变[34]。为研究人参在配伍煎煮液中的物质基础，郭迎迎等[35]将人参皂苷Rd在pH 2.0、60℃下水解5 h后，利用高分离快速液相色谱-四极杆-飞行时间质谱（RRLC-QTOF MS）联用技术鉴定出其中的C-Y1、C-Y2、F2、20（S）-Rg3、20（R）-Rg3、RK1、Rg5等主要水解产物，并由此推断了人参皂苷的化学转化方式。

报道指出人参皂苷元的抗肿瘤活性优于人参皂苷[36-37]。为研究三七茎叶皂苷活性的物质基础，Zhao等[38]通过分析鉴定三七总皂苷酸水解产物，得到了1个活性优于抗肿瘤药物人参皂苷Rg3的新抗肿瘤活性化合物25-OCH3-PPD。

多元酚类物质绿原酸为多种天然药物的有效成分，常作为中药方剂的质控指标[39]。绿原酸的稳定性受酸、碱、温度等的影响较大，易发生水解[40-41]。罗奇志等[42]发现在不同pH（4.18、5.00、6.85、9.18）、时间（1.5、3 h）条件下绿原酸的稳定性不同，水解产物存在差异（例如，在1.5 h，pH 9.18时绿原酸发生剧烈水解产生多种产物，pH 6.85时较稳定）。

4　小分子天然产物水解产物的制备

一些小分子天然产物的水解产物具有较强的生理活性，近年来，通过对小分子天然产物进行水解来制备其水解产物，以更好地利用其生物活性。

白藜芦醇苷在虎杖中含量为1.4 %～3.6 %，其具有抗病毒、抗氧化、抗肿瘤、保护肝细胞等作用[43-44]，白藜芦醇比白藜芦醇苷具有更高的生物活性，但含量仅为0.29 %～0.78 %。为提高虎杖中白藜芦醇得率，刘新荣等[45]通过正交试验优化获得虎杖白藜芦醇苷水解条件为：温度65℃，提取液为体积分数8 %HCl、75 %甲醇，反应5 h，在此条件下白藜芦醇产率可达2.06 %。

生物体内积雪草酸、羟基积雪草酸等苷元的生物利用度较其相应的三萜皂苷类物质积雪草苷和羟基积雪草苷要高；其在抗氧化、抗癌、治疗脑缺血等方面具有一定的作用[46-47]；且以积雪草酸、羟基积雪草酸等苷元出发可合成药理作用更好的苷元衍生物[48]。研究表明积雪草中皂苷含量一般为1.8 %～5 %，高于积雪草酸和羟基积雪草酸等皂苷元，含量比约为2.5∶1。为更好利用积雪草资源，贾广韬[49]研究了积雪草苷和羟基积雪草苷水解产生积雪草酸和羟基积雪草酸的条件，发现强酸强碱水解效果明显好于弱酸弱碱，建议实际操作水解条件为0.1 mol/L氢氧化钠溶液、80℃、水解时间120 min，水解过程均符合一级反应，为制备积雪草酸和羟基积雪草酸提供了方法。

黄芪甲苷为黄芪皂苷的主要成分[50]，具有强心护心、保护神经系统、降血压、镇痛镇静等作用[51]。然而黄芪甲苷在黄芪药材中的含量很低，提取分离较困难。张金红等[52]利用皂化反应原理，对黄芪药材乙醇提取物进行碱水解，将其中的环黄芪醇皂苷转化为黄芪甲苷，结果表明，在优选的最佳条件（NaOH浓度0.100 mol/L，室温静置水解2 h，料液比为1∶12（g/mL）下，所得碱水解产物中黄芪甲苷含量约是水解前的16.4倍，大大提高了其收率。

羟基酪醇具有抗氧化、抗炎、抗癌、保护心血管系统等多种生物活性[53-54]，被认为是最具清除自由基能力的天然抗氧化剂之一。羟基酪醇在自然界中含量较低，一般由橄榄苦苷经盐酸或β-葡萄糖苷酶水解制得。谢普军等[55]报道油橄榄叶橄榄苦苷粗制品在碱水解条件为温度90℃、NaOH浓度0.2 mol/L、水解时间45 min、料液比1∶15（g/mL）时，制备羟基酪醇的效率（收率17.11 %）高于酸水解（收率8.21 %）。

京尼平苷酸具有降血压、抗肿瘤、促进胶原蛋白合成、抗衰老和抗炎症等作用[56-57]，自然界含量很少。谢键泓等[58]建立了NaOH水解栀子苷制备京尼平苷酸的方法，将栀子苷经1.0 mol/L氢氧化钠溶液于70℃碱水解180 min，HPLC监测使其水解完全，然后选择H103大孔吸附树脂以动态柱层析法分离纯化京尼平苷酸，收集30 %乙醇洗脱液真空干燥得到纯度96.1 %的京尼平苷酸，此法步骤少、收率高，为大量制备京尼平苷酸的一条新途径。

小檗科植物淫羊藿具有增加冠脉血流量、心脑血管血流量，促进抗体生成、DNA合成，增强免疫、抗衰老、抗肿瘤，促进造血功能及骨代谢多种生理活性[59-61]。淫羊藿中游离型苷元占淫羊藿中黄酮的含量（约5 %）远低于结合型糖苷（约95 %），然而游离型苷元的活性远高于结合型糖苷。因此，祝江业等[62]通过单因素和正交试验研究，得到了从淫羊藿苷有效制备淫羊藿苷元且不破坏其结构的混酸水解法：温度90℃、80 %冰醋酸+5 mol/L硫酸混合酸溶液、水解72 h，在此条件下水解率可达到80 %。

5　展望

小分子天然产物安全性高，其在抗氧化、抗癌、免疫等方面已显示出很大的优势。对小分子天然产物进行水解，研究其水解动力学及水解产物，可以明确其生物活性的物质基础、构效关系，制备新型苷元，提供新药或药物的先导化合物，还可为化学合成和结构修饰提供依据，这对医药、食品及饲料的研究开发起着重要作用。小分子天然产物种类繁多，水解产物常常比较复杂，但随着基础科学和高新技术的发展，高新检测技术及分析软件的日益普及，为小分子天然产物水解动力学及水解产物的定性及制备提供了可能。然而对小分子天然产物及其水解产物活性之间关系的研究仍有欠缺，因此对小分子天然产物体外水解的研究还须结合其他学科的知识进行深入探究。

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Review：Acid/Alkali Hydrolysis of Small Molecular Natural Products

CHEN Xue-yang1，2，3，ZHOU Qian1，2，CHEN Ming4，FU Gui-ming1，2，5，HUANG Jing-yan1，2，LI Hui-xiao1，2，ZOU Bin1，2，WAN Yin1，2，*
（1. State Key Laboratory of Food Science and Technology，Nanchang University，Nanchang 330047，Jiangxi，China；2. Food Science College of Nanchang University，Nanchang 330047，Jiangxi，China；3. Nanyang Vocational College of Agriculture，Nanyang 473000，Henan，China；4. The First Affiliated Hospital of Nanchang University，Nanchang 330047，Jiangxi，China；5. Sino-German Food Engineering Center of Nanchang University，Nanchang 330047，Jiangxi，China）

Abstract：Natural resources are extremely abundant in China. Small-molecule natural products are widely used in fields such as medicine and food because of their physiological activities. By summarizing the application of in vitro acid/alkali hydrolysis methods in the preparation of highly active aglycone，the quantitative and qualitative analysis of small-molecule natural products，and the research status of hydrolysis kinetics，it provided theoretical basis for the further research of more small-molecule substances.

Key words：natural products；small-molecule；acid/alkali hydrolysis；research status

收稿日期：2015-02-04

*通信作者

作者简介：陈雪洋（1991—），女（汉），在读硕士，研究方向：营养与功能食品。

基金项目：国家自然科学基金项目（31160316）

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.08.045