黑曲霉高产糖化酶的分子水平研究方法概论

杨丽娟，余少文（深圳大学生命科学学院，广东深圳518060）



黑曲霉高产糖化酶的分子水平研究方法概论

杨丽娟，余少文*
（深圳大学生命科学学院，广东深圳518060）

摘要：黑曲霉是一株产糖化酶的特殊菌株，而糖化酶在制造葡萄糖、氨基酸、抗生素等发酵工业上有着广泛的应用。以黑曲霉出发菌株为研究材料，基因改造作为研究背景，通过综述诱变育种、基因敲除、RNA干扰、基因重组表达等分子改造技术，将改造后的菌株与出发菌株生产糖化酶的产量及活性分别进行测定评估。以此探讨高产糖化酶的黑曲霉分子改造的优良手段，为以后设计新的效率更好的高产糖化酶的黑曲霉分子改造研究提供技术支持。

关键词：黑曲霉；糖化酶；基因工程；分子改造技术

The Research Methods on Molecular of Aspergillus niger for High-yield Glucoamylase

YANG Li-juan，YU Shao-wen*
（Life Sciences，Shenzhen University，Shenzhen 518060，Guangdong，China）

Abstract：Glucoamylase，is produced by a special strain of Aspergillus niger，has been widely used in fermentation industry of glucose，amino acids，antibiotic，etc. This paper aims to evaluate the yield and activity of glucoamylase which produced by modified strain and starting strain respectively by means of molecular modification technology，such as mutation breeding，gene knockout，RNA interference and gene recombinant expression，etc. With Aspergillus niger starting strain as the research material and gene modification as the research background，in order to explore the excellent means of molecular modification on Aspergillus niger for highyield glucoamylase，this paper provides technical support for later research on the modification of Aspergillus niger with new efficiency and better yield.

Key words：Aspergillus niger；glucoamylase；genetic engineering；molecular modification

糖化酶是目前最重要的工业酶制剂之一，全名葡萄糖淀粉酶（glucoamylase，EC 3. 2. 1.3）[1]。糖化酶是水解淀粉产生葡萄糖的主要酶类，是一种外切型糖苷酶，从淀粉的非还原性末端依次水解α-1，4糖苷键，水解成一个个的葡萄糖单元，工业上用于将淀粉转化为葡萄糖，因此被广泛地应用于食品、医药、制酒、氨基酸、抗生素、有机酸等发酵工业[2-3]。有研究表示，麦芽糖酶糖化酶在调节糖异生和异麦芽糖酶消化淀粉合成糖类中占主导地位[4]。黑曲霉（Aspergillus niger）是市面上生产糖化酶的特殊菌株之一。黑曲霉的α-淀粉酶活性低，糖化酶活力强，多数黑曲霉的糖化酶能水解80 %以上的淀粉，与其他菌株相比较利用黑曲霉生产糖化酶具备产量高，活性好，安全性高的特点[5]。Metwally M等[6]研究者研究了有限碳源对黑曲霉产糖化酶的生物能力。温度和添加剂对黑曲霉糖化酶热稳定性也有一定的影响[7]。Lubertozzi D等[8]研究者开发黑曲霉作为异源表达宿主，Tamayo-Ramo等[9]研究者运用黑曲霉产糖化酶的表达体系来表达多铜氧化酶漆酶，Kra觢evec N等[10]利用黑曲霉丝状真菌系统表达未正确折叠的分泌蛋白G-CSF，都验证了黑曲霉具有稳定的特异的高表达蛋白酶系统。Huifang Hu等[11]研究了真菌中生产的耐热糖化酶，通过糖化酶的耐热性质从而提高发酵的产量。本文以黑曲霉的基因分子水平为研究背景，主要综述了改造黑曲霉基因组的分子结构使得此菌株高产糖化酶的优良方法。

1　诱变育种

诱变育种（mutation breeding）在外界诱导的条件下，利用物理、化学等因素，诱发生物体产生突变，使得黑曲霉的基因发生突变或分子结构发生改变，从而培育出黑曲霉的新品种。诱变方法主要有紫外、化学以及紫外化学复合诱变法和蓝光诱变等。在此基础上，筛选出符合研究需求的菌株，进行遗传稳定性试验。

康东亮[12]利用紫外线照射和光复活交替处理黑曲霉生产菌株，得到一株性能优异的变异株ZW02。摇瓶酶活力比原菌株提高26.8 %。通过正交试验，优化了分批发酵的最适工艺条件。钟浩等以产马铃薯淀粉糖化酶活为4 700 U/mL的黑曲霉菌株G作为诱变的出发菌株，对其进行紫外和化学诱变及2种方法复合诱变。结果显示：经紫外线诱变处理后，得到的变异株G-1产糖化酶活比出发菌株提高了6.4 %；经DES诱变处理后，得到的变异株G-2产糖化酶活比出发菌株提高了17.06 %；而经紫外线和DES复合诱变后，产生的变异株G-3产糖化酶活比出发菌株提高了38.2 %，达到6 500 U/mL。将菌株G-3进行连续8次传代培养后，产酶活力基本稳定[13]，证明到复合诱变的菌株产酶活力较单因素诱变强。ZHU JC等[14]也研究了蓝光促进黑曲霉产糖化酶的能力。

目前，光诱变和化学诱变是比较传统的改造黑曲霉产糖化酶能力的方法。但传统的诱变育种的有益突变频率较低，变异的方向和性质尚难控制。因此提高诱变效率，迅速鉴定和筛选突变体以及探索定向诱变的途径，是当前研究的重要课题。

2　基因敲除技术

2.1农杆菌转染法

糖化酶的活力和产量及酶制剂的高纯度在近年来取得了很大的进展。但仍存在糖化酶中葡萄糖苷转移酶活性普遍较高的问题[15]。α-葡萄糖苷酶（α-glucosidase，EC3.2.1.20)又名α-D-葡萄糖苷水解酶，旧称麦芽糖酶[16]。它作用于低聚糖类底物非还原末端的α-1，4糖苷键，能将α-1，4糖苷键切开，释放出葡萄糖或将游离的葡萄糖残基转移到另一糖类底物形成α-1，6糖苷键，从而得到非发酵性的低聚异麦芽糖或糖脂、糖肽等[17-20]。在糖化酶工业生产中伴随着α-葡萄糖苷酶产物的生成，影响了糖化酶的活性及产量。因此，需要运用基因敲除的方法去除糖化酶产物中的α-葡萄糖苷酶。

利用基因工程的方法敲除或破坏黑曲霉丝状真菌中的基因，用于特定的应用或研究基因功能，外源基因可通过同源重组的方式整合到黑曲霉宿主基因组中。农杆菌转染法是丝状真菌遗传操作方法中比较传统的转化率较高的外源基因导入丝状真菌的方法[21-22]。MICHIELSE CB等[23]利用根癌农杆菌介导外源基因，成功转化黑曲霉丝状真菌。王露等[24]利用农杆菌侵染方法，基于载体DNA与受体DNA之间双交换原理，成功将黑曲霉中α-葡萄糖苷酶基因敲除掉，得到高产柠檬酸的α-葡萄糖苷酶基因缺陷的黑曲霉株。基于同源重组的方法，构建敲除表达株，通过这种方案筛选高产糖化酶，不产或少产α-葡萄糖苷酶的黑曲霉菌株，给工业上纯化糖化酶的工序降低了成本，并提高了效率。

2.2RNA干扰技术的应用

RNA干扰（RNA interference，RNAi）是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA（dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。1998年，Andrew Z. Fire等[25]研究者揭示了RNA干扰的实质是使转录的基因沉默。因此RNA干扰又被形象地称为基因沉默，和基因敲除具有异曲同工之妙。最初这种技术被应用于研究植物基因组，2004年，Baulcombe D阐述了植物中RNA干扰的原理及机制[26]。Meister G等[27]研究了double-stranded RNA沉默基因的机制。随后各种细菌、真菌等多种微生物，果蝇、小鼠等动物的RNA干扰技术也应运而生。Gerrit C. S等研究者发现病毒类木瓜蛋白酶P29抑制天然真菌宿主的RNA沉默[28]。接着T. M. Hammond等[29]研究者又发现曲霉属真菌病毒是RNA沉默的抑制子。Oliveira JM研究者[30]构建共转化的基因沉默表达载体pXLNRir成功将黑曲霉中的纤维素降解基因XlnR敲除掉。2009年，S Maiyuran和H Brody[31]研究了RNA干扰在工业真菌菌株中的应用，通过RNA介导成功将里氏木霉和黑曲霉中高表达的基因沉默了。近几年来RNAi研究取得了突破性进展。由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，所以该技术也被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的治疗领域[32-33]。而在真菌基因功能的研究领域，有研究者利用RNAi技术将里氏木霉内源性高表达基因沉默使得外源脂肪酶生产量提高[34]。银超[35]等验证了RNAi技术可以有效降低黑曲霉宿主内源蛋白的表达背景，有利于提高外源基因在黑曲霉细胞工厂中的表达水平和稳定性。

以基因工程法构建α-葡萄糖苷酶基因的siRNA敲除载体，将载体导入黑曲霉中表达，干扰α-葡萄糖苷酶基因合成糖苷酶，去除影响同一菌株糖化酶表达的活性和产量，使得糖化酶可以高效表达，理论上具有可行性。若黑曲霉的质粒转染效率较低（低于70 %），则采用腺病毒或慢病毒载体，利用病毒载体的高感染率、高表达特性，更好地开展RNA干扰主体实验[36]。从而成功沉默黑曲霉中α-葡萄糖苷酶基因，得到的糖化酶产物更纯，活性更高。

2.3Split-Marker分割标记法

在基因敲除的过程中，往往涉及到敲除载体的构建，耗时较长。Split-Marker分割标记删除方法，通过融合PCR[37]可直接将含有选择性标记的基因分别与要敲除的基因的5’端和3’端（约1 000 bp）组成两个片段。将重组好的含同源序列的两个片段共转化丝状真菌，重叠区域的选择标记基因与基因组对应的基因序列通过侧翼的两端同源序列发生重组，使靶基因缺失，从而表现出选择性标记的活性。

2005年，J. Fu等[38]利用Split-Marker分割标记法提高了新型隐球菌的同源重组效率，发展了传统的分子生物技术改造方法。YU Na na等[39]通过Split-Marker分割标记法，对烟曲霉（Aspergillus fumigatus）泛素末端水解酶（creB）基因进行敲除，结果显示烟曲霉CreB蛋白具有泛素特异蛋白酶（ubiquitin-processing protease）UBP亚家族6个结构域，最后验证了Split-Marker重组技术是对烟曲霉creB基因进行敲除的快速有效的方法。2011年，Rubella S. Goswami[40]诠释到，目标基因替换是真菌基因功能鉴定的主要策略，基因组序列信息可用性的增加使得基于此基因周围区域的序列能够被广泛的用于科学试验。因此Split-Marker在丝状真菌中得到普及，这种方法只涉及两轮PCR，不需要任何的亚克隆。它基于一个标记基因（例如：潮霉素或遗传霉素）的基因序列，以及靶基因两侧约1 kb的区域。该技术包括标记基因和靶基因两端1kb的3个序列的PCR扩增，以及两侧片段分别与标记基因融合的PCR分子表达盒，都含有标记基因的一部分融合到一个侧翼区。这些分子的表达盒同时用于原生质体转化。进行三同源重组，融合的一个侧翼区为标记基因，置换功能性基因的片段。转化时可用置换的选择性标记基因来筛选阳性转化子。

3　糖化酶基因的克隆与表达

自DNA重组技术发展以来，有研究者试着将糖化酶基因克隆到埃希大肠杆菌和酵母菌中，构建了高产糖化酶的工程菌。研究者们根据真菌基因表达的需求构建独立的代谢表达系统[41]。近几年来，吴晓萍等[42]将切除了5'端非编码区50碱基对片段的黑曲霉糖化酶GA I cDNA与大麦α-淀粉酶基因重组进埃希大肠杆菌-酵母穿梭载体中，构建重组表达质pMAG11，转化酿酒酵母GRF18，获得含α-淀粉酶和糖化酶双基因的酵母工程菌GRF18（pMAGII），在酵母PGK基因启动子和终止信号的调控下，α-淀粉酶和糖化酶基因获得高效表达，99 %的表达产物分泌至胞外。曹慕琛等[43]选用pFLDα和毕赤酵母X-33作为黑曲霉糖化酶表达载体和表达菌株，通过RT-PCR的方法扩增得到黑曲霉糖化酶的编码基因，亚克隆构建表达载体pFLDα -glaAm，获得重组毕赤酵母X-33 /pFLDα-glaAm，SDS-PAGE和活性电泳Starch-PAGE显示，发酵液中有目标蛋白表达，酶活达到30 U/mL，表明用毕赤酵母X-33和表达载体pFLDα能很好地表达糖化酶。此外，Min Jin Kwon等[44]研究者研究了黑曲霉的糖化酶基因在胁迫环境下表达的转录图谱，验证了糖化酶蛋白胞外高水平分泌的机制，为糖化酶基因在其他宿主细胞中的重组表达及胞外分泌提供参考。

黑曲霉糖化酶的基因能在其它宿主菌中得到稳定的克隆表达。由于黑曲霉自身是一种生产糖化酶的高效菌株，以它作为出发菌株，从分子水平上改造与糖化酶表达相关的特殊基因，如给糖化酶基因加上一个强启动子[45]，这样既能高效驱动糖化酶基因的表达，又不用改变宿主菌种。

4　展望

对高产糖化酶的黑曲霉菌株的分子改造方法，仍然属诱变育种改造后的糖化酶酶活及产量最高，其次是黑曲霉中α-葡萄糖苷酶的敲除，而糖化酶基因的异源表达技术虽成熟，但得到的酶活和产量并不理想。但是黑曲霉诱变育种的有益突变率低，变异的方向和性质难以掌控，因此提高突变率和解决不定向诱变的问题是未来研究的热潮。Split-Marker分割标记法周期短，DNA转化效率高，将成为未来研究领域的主导方法。

虽然各种研究手段对黑曲霉高产糖化酶的研究都取得了一些显著的成果，但试验结果揭示出的技术问题也层出不穷。特别对于新型的RNA干扰技术，试验过程中的每个细节还都需要进一步完善。未来有望将基因敲除和基因重组两种技术相结合的基础上，探究黑曲霉高产糖化酶的研究方法。

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收稿日期：2015-05-18

*通信作者：余少文（1959—），男（汉），副教授，硕士，研究方向：应用微生物学。

作者简介：杨丽娟（1990—），女（汉），在读研究生，研究方向：应用微生物学。

基金项目：深圳市基础研究计划项目（JCYJ20140418091413587）

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.08.048