雷公藤制剂抑制小鼠耳肿胀谱效关系研究

刘雪梅， 林 兵， 刘志宏， 杨丽娜， 池 婕， 宋洪涛*

（1.福建中医药大学药学院，福建福州350108；2.南京军区福州总医院药学科，福建福州350025）



雷公藤制剂抑制小鼠耳肿胀谱效关系研究

刘雪梅1，2， 林 兵2， 刘志宏2， 杨丽娜2， 池 婕2， 宋洪涛2*

（1.福建中医药大学药学院，福建福州350108；2.南京军区福州总医院药学科，福建福州350025）

摘要:目的 考察不同厂家雷公藤多苷片指纹图谱及抗炎药效，并分析指纹图谱与抗炎药效的关联性。方法 采用高效液相色谱法（HPLC）建立7个厂家雷公藤多苷片指纹图谱，得到11个共有峰；选择二甲苯致小鼠耳肿胀炎症模型进行抗炎药效学研究；采用灰色关联度分析法研究11个共有峰与其抗炎药效的相关性。结果 各厂家雷公藤多苷片指纹峰数目和大小差异较大且均有抗炎作用；构建了雷公藤多苷片“谱-效”模型，各共有峰与抗炎药效的关联度均大于0.5，其中9号峰和6号峰对药效的贡献较大（关联度均大于0.77），各峰所代表的化学成分对其抗炎作用贡献的大小顺序为: 9＞6＞3＞5＞1 =10＞4＞8＞2 =11＞7。结论 不同厂家雷公藤制剂指纹图谱不同，抗炎药效亦不同，其是共有峰所代表的化学成分群综合作用的结果，将两者进行关联度分析结果显示，各峰与药效的关联度不等，对药效的贡献强弱不同。

关键词:雷公藤；雷公藤多苷片；HPLC；抗炎；谱效关系；灰色关联度法

dol:10.3969/j.issn.1001-1528.2016.02.042

雷公藤是卫矛科雷公藤属植物雷公藤TriPterygium Wilfordii Hook.f.的干燥根。主要含有二萜类、三萜类、生物碱类等成分，具有显著的抗炎、免疫抑制药理活性［1］。目前，已经上市的雷公藤制剂有雷公藤多苷片、雷公藤片和雷公藤总萜片等，临床上多用于类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、肾病综合症等自身免疫疾病，疗效显著。但其毒性较大，不良反应高发，总不良反应发生率为58.1％，严重程度通常是患者不能耐受的［2］，从而严重影响了其临床应用。究其原因，雷公藤制剂中有些成分既是药效成分又是毒性成分，治疗窗口窄，质量控制方法不完善［3］。本研究建立了雷公藤多苷片的指纹图谱，开展雷公藤制剂谱效关系研究，为深入研究雷公藤药效物质基础及建立较完善的质量控制方法提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器 1200型快速高效液相色谱仪、XDB-CN色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）（美国Agi1ent公司）；KQ-800KDE型超声波清洗器（上海超声波仪器有限公司）；YO-202型电子天平（上海精密仪器科学有限公司）；SePPak中性氧化铝柱（6 cc/1 g，美国Waters公司）；UV-2501型紫外-可见分光光度计（日本岛津公司）；6 mm直径打孔器（温州新星五金工具厂）。

1.2 试剂 乙腈、甲醇（色谱纯，美国Sigma公司）；乙酸乙酯、二甲苯（分析纯，上海联试化工试剂有限公司）；阿司匹林肠溶片（批号BJ14634拜耳医药保健有限公司）；雷公藤甲素（批号111567-200502，纯度≥99％，南京泽朗医药科技有限公司）；雷公藤内酯酮（纯度≥98％，南京泽朗医药科技有限公司）；雷公藤次碱（纯度≥98％，批号131229，南京景竹生物科技有限公司）；雷公藤多苷片购买自A（批号120905）、B（批号120917）、C（批号20120802）、D（批号20120901）、E（批号120502）、F（批号121202）、G（批号120601）7个厂家。

1.3 动物 清洁级KM小鼠，雄性，90只，体质量18～22 g，由南京军区福州总医院比较医学科提供，合格证号SCXK（沪）2012-0002。

2 方法与结果

2.1 供试品及样品的制备

2.1.1 供试品的制备 取雷公藤多苷片适量，研磨，精密称取0.2 g，加乙酸乙酯30 mL，超声提取10 min，放冷，过滤，取15 mL滤液用中性氧化铝柱纯化，收集流出液，再用乙酸乙酯洗脱，收集洗脱液，合并流出液和洗脱液，吹干，残渣用2 mL甲醇溶解，过0.22 μm滤膜，即得指纹图谱所需的供试品。

2.1.2 样品的制备 雷公藤多苷片按照“2.1.1”项供试品前处理的方法得到吹干后样品，加吐温-80水浴加热（60℃）溶解，再用生理盐水（0.9 ％ Nac1溶液）稀释成6 mg/kg的溶液用于药效试验。

2.1.3 对照品的制备 取雷公藤甲素、雷公藤内酯酮、雷公藤次碱适量于10 mL量瓶中，加乙腈溶液溶解并稀释至刻度，制得对照品溶液。

2.2 雷公藤多苷片指纹图谱的建立

2.2.1 色谱条件 Agi1ent XDB-CN色谱柱（4.6 mm× 250 mm，5 μm）。流动相:乙腈（A）-水（B），梯度洗脱（0～15 min，25％～32％ A；15～35 min，32％～42％ A；35～56 min，42％～82％ A）；检测波长218 nm；柱温30℃。体积流量: 1.0 mL/min。进样量10 μL，记录56 min色谱图。

2.2.2 方法学考察 经方法学考察，共有色谱峰的相对保留时间、相对峰面积的精密度、稳定性和重复性均符合要求，RSD均小于5％。

2.2.3 HPLC指纹图谱及共有峰的建立 分别精密吸取雷公藤甲素、雷公藤内酯酮、雷公藤次碱和供试品溶液照“2.2.1”项色谱条件进行检测，记录色谱图，结果见图1和图2。选定11号峰为对照峰，采用国家药典委员会编写的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版”相似度软件，对7个厂家（A～G表示）雷公藤供试品的HPLC指纹图谱进行处理，得到对照指纹图谱，结果见图3。

1.雷公藤甲素 3.雷公藤内酯酮 11.雷公藤次碱图1　雷公藤对照品的HP L C图

图2　各厂家雷公藤多苷片样品H P L C图

图3　雷公藤多苷片对照指纹图谱

2.3 抗炎药效研究

2.3.1 实验方法 选取雄性小鼠（18～22 g）90只，随机分为9组，每组10只。空白对照组给予生理盐水，阳性对照组给予阿司匹林肠溶片，试验组给予7个厂家的样品。阿司匹林肠溶片与样品分别按0.4 g/kg和6 mg/kg的剂量灌胃给药，1次/d，连续给药4 d。末次给药45 min后，于小鼠右耳两面涂二甲苯30 μL［4］。15 min后将左、右两耳片切下，以6 mm打孔器取下左、右耳片，立即用电子天平称重（mg），按下式计算耳肿胀度。

肿胀度=右耳质量-左耳质量

2.3.2 实验结果 结果显示，实验组A～G与阴性对照组比较，7个厂家雷公藤样品对小鼠耳肿胀均有显著抑制作用，且作用不等，其中A～E厂家的P＜0.01，F和G两个厂家的P＜0.05。原因可能是各厂家原料药的来源、提取纯化工艺、质量控制方法不同，使得制剂中成分和含有量不同，使得药效产生差异。结果见表1。

表1　抗炎活性实验结果（n=1 0，±s）

表1　抗炎活性实验结果（n=1 0，±s）

注:与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

组别　　肿胀度/mg阴性对照组　9.8±1.7阳性对照组　2.5±1.2**A 3.3±1.1**B 4.2±1.4**C 5.0±1.3**D 6.0±1.2**E 6.2±1.2**F 7.6±1.3*G 7.2±1.5*

2.4 抗炎谱效关系的建立

2.4.1 共有峰峰面积与关联度 采用“灰色系统理论建模软件（GTMS3.0）”，中的灰色关联分析。以各共有峰峰面积和抗炎药效数据为序列，分别计算药效与峰面积序列的关联度，用以分析指纹图谱各色谱峰与抗炎药效的相关性，结果见表2。

2.4.2 谱效关系的关联度分析 由结果可知，指纹图谱中各个色谱峰所代表的化学成分与抗炎作用具有一定的关联（关联度均大于0.53），表明雷公藤多苷片的抗炎作用是其化学成分群共同作用的结果。依据关联度的大小，各成分对抗炎作用贡献大小的顺序为9＞6＞3＞5＞1，10＞4＞8＞2，11＞7，其中1号峰为雷公藤甲素，3号峰为雷公藤内酯酮，11号峰为雷公藤次碱。9和6号峰的关联度均大于0.77，表明其所代表的化学成分与抗炎作用的关联性较大。

3 讨论

雷公藤制剂化学成分多，结构复杂，分析起来难度较大。在试验的过程中以指纹峰数目和分离度为指标分别对色谱柱、洗脱程序、检测波长、流动相、柱温等色谱条件进行了优化，将不同厂家的雷公藤制剂供试品溶液应用梯度洗脱，使得其中的化学成分得以分离。

表2　不同样品共有峰峰面积与关联度

对流动相系统进行选择时，由于甲醇在203 nm下有较大吸收，而雷公藤制剂中大多数有效成分均存在末端吸收，因此选择乙腈作为流动相，对乙腈-水、乙腈-0.1％磷酸、乙腈-0.1％冰醋酸、乙腈-0.1％磷酸-0.2％三乙胺［5-8］系统进行选择，发现乙腈-水系统作为流动相分离效果最好，并对几种不同固相萃取方法:中性氧化铝柱、硅胶柱、MAX柱、HLB柱以及基质分散固相萃取方法进行比较。结果发现，中性氧化铝柱能较好的将有效成分保留且能使指纹峰的分离度达到要求；因此选择中性氧化铝柱进行萃取。

抗炎药效研究选择的是二甲苯致小鼠耳肿胀模型，经过预试验选择了药效较好的剂量6 mg/kg，选择该剂量考察各厂家雷公藤制剂对耳肿胀的影响。结果显示，不同厂家雷公藤制剂样品均有抑制小鼠耳肿胀的作用且作用强度不同。

目前中药谱效关系学主要应用于单味药材的质量评价和中药复方的药效物质基础这两方面［9］。用于谱效分析的方法有相关分析、聚类分析、灰色关联度分析、回归分析、主成分分析等［10］。灰色关联度分析来自灰色系统理论，基本思想是一种相对性的排序分析，根据序列曲线几何形状的相似程度来判断其联系是否紧密。如果一组几何曲线形状越相似，则关联度越大，反之则越小，由此从所考察的复杂系统中找出主次因素，为系统综合决策及提高综合效益提供信息。也就是说两者在发展过程中相对变化基本一致，则认为两者关联度大，反之，两者关联度小［11］。

本研究采用灰色关联度分析法对指纹图谱共有峰峰面积和药效数据分析，结果表明指纹图谱中11个共有峰所代表的化学成分与抗炎药效的关联度均大于0.5，说明这11个峰均与药效有关，证明雷公藤的药效是多成分共同起效的结果。其中6和9号峰的关联度大于平均关联度（0.59），是11个共有成分中的主要药效组分。再比较各个峰的变异系数（CV％），发现除了11号峰变异系数较小（1.8％）外，不同厂家雷公藤制剂其它峰变异较大，提示不同厂家雷公藤制剂主要药效组分的差异可能是造成药效（肿胀度）差异的主要原因。

本研究采用灰色关联度分析法建立了雷公藤制剂的指纹图谱与其抗炎药效的谱效关系，明确了指纹图谱代表的化学成分与抗炎作用关联的大小，后续的研究将对11个共有峰进行质谱的分析，表征具体抗炎作用的物质成分，为进一步对其它药效物质基础的深入研究和雷公藤的质量控制提供借鉴。

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*通信作者:宋洪涛（1968—），男，博士，主任药师，博士生导师，研究方向为药剂学和临床药学。Te1:（0591）22859459，E-mai1: sohoto@viP.163.com

作者简介:刘雪梅（1987—），女，硕士生，从事药物新剂型与制剂新技术。Te1:（0591）22859972，E-mai1: 496294479@qq.com

基金项目:福建省科技计划重大项目（2012I1001）

收稿日期:2014-12-24

中图分类号:R285.5

文献标志码:B

文章编号:1001-1528（2016）02-0425-03