幽门螺杆菌感染对细胞自噬影响的研究进展

白露艳，马岚青

(昆明医科大学第一附属医院，昆明650032)



幽门螺杆菌感染对细胞自噬影响的研究进展

白露艳，马岚青

(昆明医科大学第一附属医院，昆明650032)

幽门螺杆菌(Hp)是一种广泛定植于人胃黏膜的革兰阴性菌，它与慢性胃炎、消化性溃疡、胃癌的发生密切相关。自噬是真核生物进化过程中的高度保守过程，可清除细胞内的病原微生物，对维持机体内坏境起重要作用。近年研究发现，Hp能够入侵胃上皮细胞和某些免疫细胞，诱导自噬的发生，并可在自噬体中复制后被清除。 Hp介导自噬的分子机制错综复杂，目前认为Hp介导自噬与活性氧、细胞外信号调节激酶、未折叠蛋白反应、低密度脂蛋白受体相关蛋1、PI3K/Akt信号通路有关。

幽门螺杆菌；自噬；空泡毒素A ；细胞毒素相关蛋白A；活性氧；未折叠蛋白反应

幽门螺杆菌(Hp)是广泛定植于胃黏膜的革兰阴性菌，目前已知其与慢性胃炎、胃和十二指肠溃疡、胃黏膜相关的淋巴样组织淋巴瘤和胃癌的发生密切相关。 Hp可产生多种致病因子，如尿素酶、空泡毒素(VacA)以及细胞毒素相关蛋白(CagA)、脂多糖(LPS)，这些毒力因子参与了疾病的发生、发展。Hp感染对人类的健康造成了巨大威胁，三联、四联疗法是国内外推荐的一线治疗方法，但随着Hp对常用抗生素耐药率的增加导致其根除率日益下降。自噬是真核生物进化过程中的高度保守过程，是机体抵抗外来刺激的保护机制。近期有研究表明，Hp可诱导自噬从而保护机体免受毒素损害。本文对Hp如何介导自噬进行综述，为Hp感染的防治提供新思路。

1　Hp与自噬的关系

当前一系列证据提示，Hp能够在巨噬细胞、树突细胞和胃上皮细胞中诱导自噬。Terebiznik等[1]首先报道，胃腺癌上皮细胞(AGS)被Hp60190菌株感染后诱发自噬，用Western blot检测到细胞溶质自噬相关蛋白LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ转化，荧光显微镜下观察到GFP-LC3向自噬小体聚集；另一方面，Hp诱导的自噬可降解AGS内的VacA，抑制其对宿主细胞的损伤，这体现自噬可能是宿主细胞对抗Hp感染的一种自我保护机制。然而，Raju等[2]报道，AGS细胞孵育于VacA+Hp培养上清液24 h，会诱导产生缺乏降解底物的组织蛋白酶D的自噬小体；通过Western blot检测到自噬降解底物p62表达增加，LC3Ⅰ向LC3Ⅱ转化减少。提示自噬减弱，并且这些自噬小体成为Hp在细胞内存活和复制的庇护所，最终导致持续性炎症和胃癌。以上均表明VacA的慢性作用可扰乱细胞的自噬降解过程。

Chu等[3]首次报道，自噬增强剂Rapamycin能够增强Hp清除。该研究小组还发现，Hp将自噬体作为其生存复制的地方，但是这些自噬体与溶酶体结合后能够降解自噬体内的细菌。Tang等[4]发现，慢性持续性Hp感染患者自噬比未感染人群低，进一步研究发现小分子RNA MIR30B在各种人胃上皮细胞系(包括AGS)和Hp感染胃黏膜组织中高表达，过表达的MIR30B可以抑制BECN1和ATG12的表达进而抑制自噬；其次，通过化学抑制自噬也证实能够增加Hp胞内存活。

近期有研究[5]表明，唾液酸和儿茶素等药物能够对Hp所致胃部损伤起到潜在的保护作用,其机制可能与Hp感染的胃上皮细胞上调细胞生存相关的自噬和下调死亡相关的凋亡从而降低了炎性反应有关。

2　Hp介导自噬的分子机制

Hp介导自噬的分子机制错综复杂，目前认为Hp介导自噬与活性氧(ROS)、细胞外信号调节激酶(ERK)、未折叠蛋白反应(UPR)、低密度脂蛋白受体相关蛋1(LRP1)、PI3K/Akt信号通路有关。

2.1ROSROS是一类化学性质活泼、具有较高氧化活性的分子或离子的总称,主要包括超氧阴离子(O2-)、过氧化氢(H2O2)、羟自由基(HO)、一氧化氮(NO) 等。有文献报道，用VacA孵育胃黏膜上皮细胞，可导致细胞内ATP水平降低和ROS水平升高[6]。Calvino-Fernández等[7]发现，Hp感染后ROS升高，且ROS的量随Hp感染量和感染时间升高。在坏死性小肠结肠炎疾病中，TNF-α可造成线粒体功能异常，进而导致内源性ROS水平升高，引起自噬[8]。Tsugawa等[9]发现，Hp感染胃黏膜上皮细胞后，m1型VacA与LPR1结合导致ROS聚集、谷胱甘肽水平降低进而使Akt磷酸化，活化的Akt通过泛素-蛋白酶体系统诱导鼠双微基因2(MDM2)介导p53降解从而激活自噬，而自噬的激活使得CagA降解。Ishimoto等[10]研究表明，CagA在CD44v9表达阳性的肿瘤干细胞上得以蓄积，主要是由于CD44v9表达阳性细胞通过xCT介导胱氨酸吸收增加，进而促进谷胱甘肽的合成抑制自噬所致，表明CagA的聚集可能是Hp与胃癌之间的分子联系。近期研究发现柳氮磺吡啶为xCT抑制剂，可抑制CagA在CD44v9表达阳性的肿瘤干细胞上聚集。有文献[11]提出，ROS聚集可激活 p38有丝分裂原蛋白激酶(MAPK)信号通路进而激活凋亡和自噬。这些研究都提示了ROS与自噬密切相关。

2.2ERKERK是MAPK中的一员。有文献[12]报道，某些抗肿瘤药物引起肺小细胞肺癌A549细胞激活ERK1/2信号途径进而激活自噬发生。Kim等[13]报道，Raf/MEK/ERK信号通路的激活通过上调LC3、SQSTM1 mRNA水平进而激活自噬。CagA通过Ⅳ型分泌系统进入宿主细胞后, 其C端的酪氨酸位点发生了酪氨酸磷酸化, 磷酸化的CagA可以特异地与SHp-2结合并激活其磷酸酶活性, 这种相互作用激活了多个信号级联反应。Chen等[14]发现，烯醇化酶-α(ENO1)在感染了CagA+Hp的AGS中过表达，利用MAP激酶抑制剂U0126降低MEK1和MEK2的活性从而阻碍ERK1/2磷酸化，36 h后通过Western blot检测到ENO1表达水平较空白对照组降低，这提示了CagA通过MEK/ERK通路介导ENO1过表达。近期有研究发现，ENO1沉默的细胞内自噬相关标志物LC3Ⅱ及ATG4B的表达水平增高，提示自噬被激活。以上为CagA与胃癌分子机制的研究提供了一个新的思路。

2.3内质网内质网是哺乳动物细胞内重要的膜性细胞器，缺氧、缺血再灌注、药物、中毒、感染、营养物质缺乏等生理病理因素均可诱导内质网应激[15]。在内质网应激传导通路中，最为重要的通路为UPR。Wang等[16]发现，UPR中PERK通路的转录活化因子4(ATF4)和C/EBP同源蛋白(CHOP)可以上调自噬相关基因微管相关蛋白1轻链3B(MAP1LC3B)和ATG12，可诱导自噬发生。有文献[17]报道，抑制UPR 中的重要分子肌醇依赖酶1(IRE-1)可以显著抑制自噬，X-盒结合蛋白1(XBP1)对细胞自噬也有重要影响[18]。Hp0175是Hp的一种肽基脯氨酰异构酶，属于分泌型抗原。有学者发现，Hp0175可以在胃上皮细胞和单核细胞系中调节宿主细胞的信号通路和诱导细胞凋亡[19，20]。Halder 等[21]首先发现，Hp0175能够上调自噬相关基因如MAP1LC3B、ULK1、ATG5和BECLIN1，通过蛋白印记检测LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ转化的量，发现敲除Hp0175的突变株感染AGS比野生株处理的细胞自噬减弱；用野生株与敲除了Hp0175的细菌分别处理细胞，发现野生株诱导UPR相关基因ATF4、CHOP、PERK的转录水平上调，敲除ATF4使得MAP1LC3B、ULK1、CHOP 和 ATG5表达减少，而敲除了CHOP使得ATG5表达减少，这提示了Hp0175在UPR介导的自噬中发挥了重要作用。

2.4LRP1LRP1是低密度脂蛋白受体家族的成员，它首先在内质网中被合成一个600 kD的单链前体，而后在高尔基体中经过剪切，加工成双链异二聚体成熟形式，包括胞外含有配体结合位点的515 kD肽链和胞内85 kD单次跨膜肽链[22]。当前一系列研究结果表明,LRP1能够启动和调节多条信号通路，如MAPK、胰岛素受体、Akt、ERK以及JNK信号通路[23]。Yahiro等[24]发现LRP1在胃上皮细胞系AZ-521毒素诱导自噬的过程中充当了VacA的受体，VacA内化通过和LRP1结合调节自噬途径包括LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的生成，通过siRNA敲除LRP1结果显示VacA介导的LC3-Ⅱ的产生被抑制，同时使细胞调亡的标志物PARP分解；作为对VacA的回应，半胱天冬酶抑制剂(Z-VAD-fmk)和凋亡抑制剂(Necrostatin-1)并不能抑制VacA诱导的自噬，提示了VacA通过和LRP1结合诱导的自噬先于细胞凋亡，其他VacA受体例如RPTPα、RPTPβ和纤维连接蛋白并不能影响VacA诱导的自噬或细胞凋亡。以上研究结果说明, VacA可以通过LRP1途径介导胃癌细胞发生自噬和凋亡, 但是其详细分子机制尚不明确, 需要进一步深入研究。

2.5PI3K/Akt信号通路PI3K/Akt是一条经典的存活信号通路， 能被多种细胞外的刺激因素激活。目前认为，PI3K/Akt主要通过调控下游分子mTOR 来调节自噬[25]。另有文献[26]报道，CagA可以激活 PI3K/Akt 信号通路，进一步下调胃癌细胞抑癌基因 p21 和 p27 的表达，该机制可能与 CagA 相关性胃癌密切相关。Nakayama等[27]发现，VacA通过激活PI3K/Akt信号通路致使3β 糖原合成酶激酶(GSK3β)磷酸化，然而Hp是否通过PI3K/Akt信号通路介导自噬仍需进一步研究。

2.6JNK信号通路JNK信号通路激活可促进Bcl-2/Bcl-XL磷酸化，促使Beclin-1从Beclin-1/Bcl-2/Bcl-XL复合体中分离从而介导自噬[28]。此外还有文献[29]报道，JNK通过损伤调节自噬调制器和Sestrin 2诱导细胞自噬。Wandler等[30]发现，CagA可通过激活JNK信号通路诱导细胞凋亡。凋亡与自噬为细胞死亡的两种方式，两者之间存在复杂的交互调控，能被多种应激共同激活，共享多个调节分子，故关于CagA是否通过JNK激活自噬也可进行深入研究。

3　小结

近年来，Hp与细胞自噬的关系受到了广泛关注。目前研究表明，Hp诱导的细胞自噬活性与时间有关，短期感染细胞自噬增强，而长期的慢性感染导致细胞自噬活性减弱，这一机制可能在胃癌的发生、发展中起到重要作用。运用自噬增强剂可使胞内Hp减少，然而Hp介导细胞的分子机制错综复杂，目前仍未有研究确切阐明。自噬在Hp感染中的免疫作用也不清楚，这些问题仍有待进一步解决。是否可利用自噬这种细胞机制清除细胞内Hp而不损伤细胞本身，这为制定Hp感染的预防和治疗提供了新思路。

[1] Terebiznik MR, Raju D, Vázquez CL, et al. Effect ofHelicobacter pylori′s vacuolating cytotoxin on the autophagy pathway in gastric epithelial cells[J]. Autophagy, 2014,5(3):370-379.

[2] Raju D, Hussey S, Ang M, et al. Vacuolating cytotoxin and variants in atg16L1 that disrupt autophagy promote helicobacter pylori infection in humans[J]. Gastroenterology, 2012,142(5):1160-1171.

[3] Chu YT, Wang YH, Wu JJ, et al. Invasion and multiplication of Helicobacter pylori in gastric epithelial cells and implications for antibiotic resistance[J]. Infect Immun, 2010,78(10):4157-4165.

[4] Tang B, Li N, Gu J, et al. Compromised autophagy by MIR30B benefits the intracellular survival of Helicobacter pylori[J]. Autophagy, 2014,8(7):1045-1057.

[5] Yang JC, Chien CT. A new approach for the prevention and treatment of Helicobacter pylori infection via upregulation of autophagy and downregulation of apoptosis[J]. Autophagy, 2009,5(3):413-414.

[6] Greenfield LK, Jones NL. Modulation of autophagy by Helicobacter pylori and its role in gastric carcinogenesis[J]. Trends Microbiol, 2013,21(11):602-612.

[7] Calvino-Fernández M, Benito-Martínez S, Parra-Cid T. Oxidative stress by Helicobacter pylori causes apoptosis through mitochondrial pathway in gastric epithelial cells[J]. Apoptosis, 2008,13(10):1267-1280.

[8] Xu YN, Cui XS, Sun SC, et al. Mitochondrial dysfunction influences apoptosis and autophagy in porcine parthenotes developing in vitro[J]. J Rep Dev, 2011,57(1):143-150.

[9] Tsugawa H, Suzuki H, Saya H, et al. Reactive Oxygen species-induced autophagic degradation of Helicobacter pylori CagA is specifically suppressed in cancer stem-like cells[J]. Cell Host Microbe, 2012,12(6):764-777.

[10] Ishimoto T, Nagano O, Yae T, et al. CD44 variant regulates redox status in cancer cells by stabilizing the xCT subunit of system xc-and thereby promotes tumor growth[J]. Cancer cell, 2011,19(3):387-400.

[11] Pan BS, Wang YK, Lai MS, et al. Cordycepin induced MA-10 mouse Leydig tumor cell apoptosis by regulating p38 MAPKs and PI3K/AKT signaling pathways[J]. Sci Rep, 2015(5):13372.

[12] Hsieh MJ, Tsai TL, Hsieh YS, et al. Dioscin-induced autophagy mitigates cell apoptosis through modulation of PI3K/Akt and ERK and JNK signaling pathways in human lung cancer cell lines[J]. Arch Toxicol, 2013,87(11):1927-1937.

[13] Kim JH, Hong SK, Wu PK, et al. Raf/MEK/ERK can regulate cellular levels of LC3B and SQSTM1/p62 at expression levels[J]. Exp Cell Res, 2014,327(2):340-352.

[14] Chen S, Duan G, Zhang R, et al. Helicobacter pylori cytotoxin-associated gene A protein upregulates α-enolase expression via Src/MEK/ERK pathway: Implication for progression of gastric cancer[J]. Int J Oncol, 2014,45(2):764-770.

[15] Shi S, Tan P, Yan B, et al. ER stress and autophagy are involved in the apoptosis induced by cisplatin in human lung cancer cells[J]. Oncol Rep, 2016,35(5):2606-2614.

[16] Wang J, Kang R, Huang H, et al. Hepatitis C virus core protein activates autophagy through EIF2AK3 and ATF6 UPR pathway-mediated MAP1LC3B and ATG12 expression[J]. Autophagy, 2014,10(5):766-784.

[17] Castillo K, Rojas-Rivera D, Lisbona F, et al. BAX inhibitor-1 regulates autophagy by controlling the IRE1α branch of the unfolded protein response[J]. EMBO J, 2011,30(21):4465-4478.

[18] Vidal RL, Figueroa A, Thielen P, et al. Targeting the UPR transcription factor XBP1 protects against Huntington's disease through the regulation of FoxO1 and autophagy[J]. Hum Mol Genet, 2012,21(10):2245-2262.

[19] Basak C, Pathak SK, Bhattacharyya A, et al. The secreted peptidyl prolyl cis, trans-isomerase Hp0175 of Helicobacter pylori induces apoptosis of gastric epithelial cells in a TLR4-and apoptosis signal-regulating kinase 1-dependent manner[J]. J Immunol, 2005,174(9):5672-5680.

[20] Basu J, Kundu M. Retraction: TLR4-dependent NF-κB activation and mitogen-and stress-activated protein kinase 1-triggered phosphorylation events are central to Helicobacter pylori peptidyl prolyl cis-, trans-isomerase (Hp0175)-mediated induction of IL-6 release from macrophages[J]. J Immunol, 2015,195(4):1902-1902.

[21] Halder P, Datta C, Kumar R, et al. The secreted antigen, HP0175 ofHelicobacter pylorilinks the unfolded protein response (UPR) to autophagy in gastric epithelial cells[J]. Cell Microbiol, 2014,17(5):214-229.

[22] Boucher P, Herz J. Signaling through LRP1: Protection from atherosclerosis and beyond[J]. Biochem Pharmacol, 2011,81(1):1-5.

[23] Roura S, Cal R, Gálvez-Montón C, et al. Inverse relationship between raft LRP1 localization and non-raft ERK1,2/MMP9 activation in idiopathic dilated cardiomyopathy: Potential impact in ventricular remodeling[J]. Int J Cardiol, 2014,176(3):805-814.

[24] Yahiro K, Satoh M, Nakano M, et al. Low-density lipoprotein receptor-related potein-1 (LRP1) mediates autophagy and apoptosis caused by Helicobacter pylori VacA[J]. J Biol Chem, 2012,287(37):31104-31115.

[25] Liu B, Bao JK, Yang JM, et al. Targeting autophagic pathways for cancer drug discovery[J]. Chin J Cancer, 2013,32(3):113.

[26] Li SP, Chen XJ, Sun AH, et al. CagA+H. pylori induces Akt1 phosphorylation and inhibits transcription of p21 WAF1/CIP1 and p27 KIP1 via PI3K/Akt1 pathway[J]. Biomed Environ Sci, 2010,23(4):273-278.

[27] Nakayama M, Hisatsune J, Yamasaki E, et al. Helicobacter pylori VacA-induced inhibition of GSK3 through the PI3K/Akt signaling pathway[J]. J Biol Chem, 2009,284(3):1612-1619.

[28] Luo S, Rubinsztein DC. BCL2L11/BIM: a novel molecular link between autophagy and apoptosis[J]. Autophagy, 2013,9(1):104-105.

[29] Zhang XY, Wu XQ, Deng R, et al. Upregulation of sestrin 2 expression via JNK pathway activation contributes to autophagy induction in cancer cells[J]. Cell Signal, 2013,25(1):150-158.

[30] Wandler AM, Guillemin K. Transgenic expression of the Helicobacter pylori virulence factor CagA promotes apoptosis or tumorigenesis through JNK activation in drosophila[J]. PLoS Pathog, 2012,8(10):e1002939.

云南省教育厅科学研究基金项目(2015C010Y)；云南省高校联合专项基金项目(2012FB027)；云南省中青年学术技术带头人后备人才基金项目(2013HB087)。

马岚青(E-mail: malanqing@aliyun.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.34.040

R573；R378

A

1002-266X(2016)34-0106-04

2016-07-30)