高通量活性筛选技术在中药研究中的应用

王晓明，夏爽，李文芳,2，陈浩浩,2，潘桂湘

(1天津中医药大学，天津市现代中药国家重点实验室培育基地，天津300193；2天津国际生物医药联合研究院)



高通量活性筛选技术在中药研究中的应用

王晓明1，夏爽1，李文芳1,2，陈浩浩1,2，潘桂湘1

(1天津中医药大学，天津市现代中药国家重点实验室培育基地，天津300193；2天津国际生物医药联合研究院)

高通量筛选(HTS)技术是以药物和靶点之间的相互作用为检测指标，高通量地筛选与特定靶点具有亲和力样品的技术。与传统方法相比，HTS具有快速、高效、灵敏、经济的特点，近年来在中药研发领域得到较好的应用，有效推动了中药现代化的进程。HTS包含初筛、复筛、深入筛选、确证筛选四个过程。其模型类别包括分子水平模型、细胞水平模型和动物水平模型。HTS常用的技术包括报告基因系统、荧光影像技术、荧光标记检测、离子流检测和微量化技术。

高通量筛选；中药研究；筛选过程；筛选模型；筛选技术

高通量筛选(HTS)技术出现于上世纪80年代。与传统方法相比，HTS具有快速、高效、灵敏、经济的特点，近年来在中药研发领域得到较好的应用，对加速中药现代化进程具有积极的意义。本文从筛选过程、模型类别、筛选技术三方面对HTS进行综述。

1　HTS过程

药物的治疗作用大多由药物与机体内生物大分子特定位点(靶点)相结合而产生。HTS技术是以药物和靶点之间的相互作用为检测指标，高通量地筛选与特定靶点具有亲和力样品的技术。HTS包含初筛、复筛、深入筛选、确证筛选四个过程[1]。初筛是在细胞或分子水平模型上，初步筛选对特定靶点有作用的样品。复筛是采用与初筛一样的模型，将初筛有活性的化合物稀释成一系列的浓度，明确化合物对该靶点的作用特点、作用强度及量效关系。深入筛选是采用与初筛不同但相关的细胞或分子水平模型，结合组织、器官或整体动物模型，证明活性化合物的药理作用。深入筛选得到的化合物，可作为先导化合物进行结构改造，以得到活性更高、缺点更少的活性物质。确证筛选是对深入筛选获得的先导化合物或经结构优化的化合物，进行深入的药理作用、一般毒理及体内过程等研究。对符合药物属性的化合物，可将其确定为候选药物，启动药物开发研究程序，进行临床前研究。

2　HTS模型类别

2.1分子水平模型分子水平模型有酶、离子通道、受体、基因等类型。其优点是药物作用靶标明确，可直接获得与药物作用机制相关的信息；不足之处是只能对特定靶点的单指标进行检测，提供的药物与靶点相互作用的信息有限，难以综合评价药物的生物活性。

2.1.1酶筛选模型酶筛选模型是根据酶的作用特点，以酶的反应底物、反应产物作为检测指标，评价药物对酶活性的影响。周思多等[2]根据碘化硫代乙酰胆碱在胆碱酯酶的作用下分解生成硫代胆碱，后者进一步与显色剂DTNB迅速作用生成405 nm有光吸收黄色物质的原理，建立了基于酶标仪的乙酰胆碱酯酶抑制剂筛选模型，考察了48种中药的不同溶剂提取物对乙酰胆碱酯酶的抑制活性，发现提取物浓度对乙酰胆碱酯酶抑制活性有一定影响，提取物终浓度为76.92 mg/L时，黄柏80%乙醇提取物、元胡80%乙醇提取物和丹参乙酸乙酯提取物的AChE抑制活性较高。凌笑梅等[3]以凝血酶为靶点，建立了基于毛细管电泳法的凝血酶抑制剂筛选模型，研究黄蜀葵、两色金鸡菊和肉从蓉的提取物与凝血酶之间的作用，从11个中药单体中快速筛选出6个能与凝血酶相互作用的化合物。

2.1.2离子通道筛选模型离子通道是一类通过调节细胞内离子水平来发挥信息作用的大分子膜蛋白。离子通道筛选模型选用表达特定膜通道的细胞模型，以寻找新型膜通道拮抗剂或激活剂[4]。曹明等[5]采用全细胞膜片钳技术，探讨甘松挥发油抗心律失常的离子通道作用机制，发现甘松挥发油可浓度依赖性地抑制大鼠心肌细胞膜L型钙通道电流。金伶伶[6]采用含囊性纤维化跨膜转运调节因子(CFTR)和一种对碘高度敏感的绿色荧光蛋白突变体EYFP-H148Q的表达质粒，共转染至Fischer大鼠甲状腺上皮细胞中，建立CFTR氯离子通道荧光成像筛选模型，通过测定碘离子通过氯离子通道内流对细胞内EYFP的荧光淬灭动力学，以此来筛选自建中药样品库中能显著促进CFTR氯离子通道开放的激活剂，成功从16种中药中发现了能够纠正ΔF508-CFTR细胞质膜定位障碍的活性成分，经荧光细胞测定模型和Ussing Chamber电生理测定方法，首次确定了木兰脂素对CFTR氯离子通道具有激活作用。

2.1.3受体筛选模型受体是位于细胞膜表面或细胞内具有特异识别和结合功能的蛋白组分[7]，受体的异常变化会导致某些疾病的发生。以异常受体作为药物筛选新靶点，可为治疗疾病提供新的线索。万娟等[8]以对第二信使变化敏感的响应元件和荧光素酶报告基因，构建报告基因质粒，然后将报告基因和受体基因共转染到HEK293细胞，建立了高通量的人胰高血糖素受体拮抗剂筛选模型，对300多种中药提取物进行筛选，发现有多个提取物对胰高血糖素受体具有拮抗剂活性。唐建华等[9]将低密度脂蛋白受体/荧光素酶报告基因质粒转染至HepG2细胞中，建立了靶向LDL受体转录活性报告基因筛选模型，对500余种中药提取物进行筛选，发现决明子、泽泻、穿龙薯蓣等提取物具有阳性结果。阎雨等[10]将重组质粒pHABHis-IL6R转染至HEK293T细胞中，建立一种白介素6受体小分子拮抗剂HTS模型，对2 700个中药粗提物进行筛选，发现13个粗提物抑制率>50%。

2.2细胞水平模型细胞水平模型是在活细胞条件下研究药物对生命体功能的影响，能够比较准确地了解药物的生物学特性，尤其适用于功能蛋白难以分离、生化分析不能实现的复杂靶标或多个靶标的研究，可通过一次试验获得多个参数的高内涵信息，还可以得到部分药物的不良反应信息[11]。李璇等[12]采用与多元醇通路激活和糖尿病微血管病变密切相关的视网膜周细胞、肾小球系膜细胞，建立了一种适用于中药醛糖还原酶抑制剂高通量细胞筛选模型，采用酶促微量反应荧光法检测细胞内山梨醇含量，可有效避免中药粗提物或黄酮类提取物对反应体系的干扰。曹婧等[13]将H3R基因质粒与报告基因质粒共转染至HEK293细胞内，建立了一种基于报告基因的组胺H3受体(H3R)激活剂的高通量细胞筛选模型，对20种中药300个组分进行筛选，发现2个对H3R有活性的中药组分。范益军等[14]将胰升血糖素样肽-1(GLP-1)受体质粒和报告基因质粒共转染到CHO细胞中，建立了一种GLP-1受体激动剂的高通量细胞筛选模型，对200种中药的醇提物库进行筛选，发现5种中药有直接激活GLP-1受体的活性。

2.3动物水平模型动物水平模型适用于机制还不明确、缺少有效筛选靶点的疾病(尤其是功能缺失性遗传病)，或者影响整体器官而非个别细胞的疾病，或者器官与细胞在生理上的联系不能在体外构建，但对疾病进展至关重要的情况[15]。Moy等[16]以线虫为模型动物，采用384孔板自动显微成像分析，对37 200个化合物及中药提取物进行筛选，发现未曾报道的28个化合物及中药提取物能够提高粪肠球菌感染后线虫生存率，具有潜在抗菌活性。秦帅[17]利用分子克隆、显微注射、活体摄像等方法，建立由绿色荧光蛋白标记巨噬细胞和巨噬细胞迁移、聚集的转基因斑马鱼(Zlyz-EGFP)模型，对296种中药乙醇提取物的抗炎活性进行筛选，发现2、3、28、35号中药可以显著抑制Zlyz-EGFP斑马鱼巨噬细胞向急性损伤部位迁移、聚集。

3　筛选技术

3.1报告基因系统报告基因是指一组编码易被检测的蛋白质或酶的基因，将其与目的基因融合后，可通过荧光、比色或发光的方法检测报告基因的表达来间接报告目的基因的表达调控。目前应用较多的报告基因有β-半乳糖苷酶、荧光素酶、分泌型碱性磷酸酶及荧光蛋白家族等。韦忠红等[18]构建了pGL3-TNF-α3′UTR荧光素酶报告基因载体，并与pSVRenilla质粒组成双荧光素酶报告系统，共转染至RAW264.7单核巨噬细胞，用脂多糖诱导后HTS对TNF-α转录后调控有影响的丹参酮类成分，结果发现隐丹参酮可以对TNF-α的转录后水平进行抑制调控。

3.2高内涵筛选技术高内涵筛选技术应用高分辨率的荧光数码影像系统，在细胞水平上实现检测指标的多元化和功能化。在保持细胞结构和功能完整的前提下，尽可能同时检测样品对细胞、形态、生长、分化、迁移、凋亡、代谢途径及信号转导等多环节的影响，从单一实验中获得大量信息，确定被筛选样品的生物活性及潜在毒性。其特点是多指标、多靶点同时检测，涉及的靶点包括细胞膜受体、细胞器及胞内成分等，非常适用于中药多组分、多靶点的研究。

高内涵的生物学应用包括细胞周期、细胞毒性、细胞凋亡、细胞迁移、受体内化、G蛋白偶联受体调节剂、活性物质释放(活性氧、胞内钙离子、一氧化氮)等。在细胞毒性方面，目前已建立一种能够直接反映细胞数目、核形态学变化及线粒体聚集等多个指标的高内涵模型[19]。它利用三重荧光标记法，用Hoechst3334(EX350/EM461)标记细胞核呈蓝色，用MitoTracker(EX556/EM573)标记细胞质中的线粒体呈红色，用微管免疫印迹荧光反应二抗标记AlexaFluor488(EX494/EM519)呈绿色，经高内涵成像系统分析(蓝色荧光变化与细胞数目、核形态相关；红色荧光变化与线粒体聚集相关)，对样品造成细胞毒性的作用机理进行判断。闫秀川等[20]利用人正常肝细胞株HL-7702，以TNF-α诱导的肝细胞凋亡为筛选模型，建立基于细胞核和线粒体损伤的高内涵筛选方法，对丹参的抗肝损伤与抗肝纤维化的物质基础进行研究，发现丹酚酸A、丹酚酸B有良好的抗肝细胞凋亡作用。

3.3荧光标记检测技术荧光猝灭检测、荧光偏振检测、荧光共振能量转移检测和均相时间分辨荧光共振能量转移检测等荧光检测技术在HTS中有广泛的应用。其原理是被筛选的药物与荧光标记靶标相互作用，会导致荧光强度的改变，从而可以推测药物与靶标的相互作用信息[21]。荧光检测技术适用范围从酶抑制剂筛选，拓展到以离子通道、受体、细胞为靶点的高通量药物筛选[22]。由于仅有少数化合物可以产生荧光，对于那些缺乏荧光活性的筛选系统，常将筛选系统内的分子与荧光活性分子键合标记，以此作探针来反映样品的作用情况[23]。

中药成分具有复杂性、多效性、双向调节性等特点，在作用方式上具有多环节、多途径、多靶点的特点。HTS技术用于研究中药单体，可根据获得的结果直接评价化合物的生物活性；用于研究中药提取物，可根据筛选结果跟踪提取分离，确定活性组分或活性化合物，减少化合物分离提纯的复杂操作；用于研究中药复方，可根据筛选结果对复方的配伍、比例、活性部位等进行筛选，确定最佳复方组成及组方原理，提高中药复方的疗效。HTS技术可充分发挥中药多成分同时检测的优势，显著降低筛选成本、样品需要量、工作强度，提高中药样品的利用度。

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国家自然科学基金资助项目(81173523、81303182)；国家重大新药创制项目(2012ZX09101202)；国家973计划项目(2012CB723504)。

潘桂湘(E-mail: guixiangp@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.22.040

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A

1002-266X(2016)22-0105-03

2015-10-07)