慢性阻塞性肺疾病合并认知功能障碍患者外周血单核细胞TREM2表达及意义

王耀炜，王惠芳

(西安医学院第二附属医院，西安710038)



慢性阻塞性肺疾病合并认知功能障碍患者外周血单核细胞TREM2表达及意义

王耀炜，王惠芳

(西安医学院第二附属医院，西安710038)

目的观察慢性阻塞性肺疾病(COPD)合并不同程度认知功能障碍患者外周血单核细胞(PBMC)中髓系细胞触发受体2(TREM2)表达水平，并探讨其临床意义。方法选择COPD稳定期患者81例，其中无认知障碍19例(A组)，轻度认知障碍22例(B组)，中度认知障碍21例(C组)，重度认知障碍19例(D组)。分别采用RT-PCR法和流式细胞仪检测PBMC中的TREM2 mRNA及蛋白，采用 3.0 T 超导磁共振成像系统测定双侧海马总体积。结果TREM2 mRNA及蛋白表达量A组0.05。相关性分析显示，TREM2 mRNA及蛋白表达均与双侧海马总体积呈负相关(r分别为-0.582、-0.463，P均<0.05)。结论COPD合并不同程度认知功能障碍患者PBMC中TREM2表达增加，其可能在COPD患者发生认知障碍的过程中起重要作用。

慢性阻塞性肺疾病；认知障碍；髓系细胞触发受体2；外周血单核细胞；海马体积

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一种以气道慢性炎症为核心并伴有全身炎症反应的气流受限不完全可逆的常见肺部疾病。研究显示，COPD患者存在明显的认知功能障碍，且随着肺功能的恶化认知障碍程度进一步加重，严重者可发展至阿尔茨海默病(AD)[1]。髓系细胞触发受体2(TREM2)是新近发现的免疫球蛋白超家族受体，多表达于单核巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞等。最近研究表明，TREM2过度表达可增加AD发病风险，与编码TREM2的基因突变相关[2]。人的海马是双侧结构，位于大脑半球内，与注意力、记忆力等认知功能密切相关。既往对COPD合并认知障碍患者外周血单核细胞(PBMC)是否表达TREM2，以及其表达变化是否与认知障碍相关的研究报道较少。本研究观察了TREM2基因在COPD合并认知障碍患者PBMC中的表达及规律，初步探讨其作用机制，为防治COPD合并认知功能障碍奠定基础。

1　资料与方法

1.1临床资料选择2013年1月～2015年3月西安医学院第二附属医院收治的COPD稳定期患者81例，男74例、女7例，年龄68～85(71.5±6.0)岁，病程(24.5±6.0)年。入选标准：①符合中华医学会呼吸病学分会2007 年制定的《慢性阻塞性肺疾病诊治指南》中的诊断标准。②病情稳定，无急性感染。③高中以上文化程度。④排除脑重要部位(额叶、颞叶)梗死，甲状腺功能低下，严重躯体疾病或精神类疾病、慢性酒精中毒、肺性脑病、严重肝病、肝性脑病、低血糖反应、糖尿病酮症等与认知障碍相关的疾病。就诊当日简易精神智能评定量表(MMSE)评估，无认知障碍(MMSE≥27)19例(A组)，轻度认知障碍(21≤MMSE<27)22例(B组)；中度认知障碍(10≤MMSE<20)21例(C组)，重度认知障碍(MMSE<9)19例(D组)。4组临床资料具有可比性，入选者均知情同意。

1.2PBMC的分离采集受试者清晨空腹肘静脉血3 mL，加入单核细胞分离液，参照文献[3]方法提取PBMC。

1.3PBMC中TREM2 mRNA检测采用RT-PCR法。按试剂盒说明书提取总RNA，测定总RNA的浓度和纯度，使A260/A280值>1.8后行一步法cDNA反转录反应。取cDNA 4 μL配制PCR反应溶液，依次加入模板引物和Tap酶至总反应体系20 μL，置于PCR扩增仪上进行PCR反应。TREM2 mRNA的PCR条件：94 ℃ 2 min，然后94 ℃变性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40个循环；扩增片段长度为120 bp。β-actin的PCR条件：94 ℃ 3min，94 ℃变性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，30个循环；扩增片段长度为123 bp。最后用1.5%琼脂糖凝胶电泳，Marker和各组PCR产物上样量均为5 μL，得到目的基因和内参的条带；经凝胶成像分析系统扫描后，以目的基因与内参的光密度(OD)值表示TREM2 mRNA的相对表达量。TREM2 mRNA和内参β-actin的引物序列由本实验室设计，上海基康生物公司合成。TREM2 mRNA扩增引物及荧光探针：上游引物为5′-TGGTCAGAGGGCTGGACTGT-3′，下游引物为5′-TCCTGGCTGGACTTAAGCTGTAG-3′，荧光探针为5′-FAM-ATTCTCTCACGTACCTCCGGGTCCAGTG-MGB-3′；β-actin扩增引物及荧光探针：上游引物为5′-AGCGGTTCCGATGCCCT -3′，下游引物为5′-AGAGGTCTTTACGGATGTCAACG-3′，荧光探针为5′-FAM-CCTTCCTTCTTGGGTATGGAATCCTGTG-BHQ1-3′。

1.4PBMC中TREM2蛋白检测采用流式细胞仪(BD公司)检测，CellQuest软件分析。首先通过大鼠抗小鼠TREM2多克隆抗体与单核细胞表面TREM2受体蛋白结合，再用异硫氰酸基荧光素(FITC)标记的山羊抗大鼠IgG二抗与多克隆抗体结合；上机通过流式细胞仪检测FITC的量，最后得出平均荧光强度,用此间接表示细胞膜表面TREM2蛋白表达量。

1.5双侧海马总体积测算应用美国GE公司3.0 T超导磁共振成像系统对入选者进行头部扫描，在ADM4.4图像处理工作站分析测算双侧海马总体积。为排除颅腔体积对海马体积大小的影响，根据公式(Vs=Vp×Cn/Ct)对海马体积进行标准化处理。其中Vs为标准化后海马体积，Vp为原始海马体积，Cn为个体颅腔体积，Ct为全体受试对象颅腔体积。

2　结果

2.1各组PBMC中TREM2 mRNA及蛋白表达比较TREM2 mRNA及蛋白表达量A组

2.2各组双侧海马总体积比较A～D组双侧海马总体积分别为(8.36±0.63)、(7.23±0.56)、(4.02±0.34)、(3.86±0.35)cm3，C、D组与A、B组比较P均<0.05，A、B组间与C、D组间比较，P均>0.05。

表1　各组PBMC中TREM2 mRNA及蛋白表达比较

注：与A组比较，*P<0.05；与B组比较，#P<0.05；与C组比较，△P<0.05。

2.3TREM2表达与双侧海马总体积的关系相关性分析显示，TREM2 mRNA及蛋白表达均与双侧海马总体积呈负相关(r分别为-0.582、-0.463，P均<0.05)。

3　讨论

COPD常呈进行性发展，主要累及肺脏，也可导致肺外器官的损害，如神经系统受损。认知功能损害在COPD患者中普遍存在[4]，已经成为临床重点关注的问题。既往研究认为，缺氧是导致认知功能障碍的首要原因，另外慢性炎症、二氧化碳潴留、肺功能进行性下降等均可导致认知障碍逐渐加重[5]。认知障碍是痴呆的高危因素。Li等[6]发现，与普通人相比，COPD患者患老年痴呆症的概率明显增加。Villeneuve等[7]发现，有轻度认知障碍的患者有一半在3年内发展为痴呆。2006年的一项研究表明，认知障碍是COPD患者死亡的独立危险因素[8]，以慢性缺氧及系统性炎症为特征的COPD患者或许是AD的一种亚临床表现。

TREM2是表达于髓系细胞膜表面的先天性免疫受体，属于免疫球蛋白超家族成员之一。最新研究显示,TREM2基因突变与多种神经退行性疾病存在相关性。Borroni等[9]报道，TREM2 Q33X、R47H、T66M、S116C等位点在有额颞痴呆的患者中存在明显突变，而健康人中未发现。Rosenthal等[10]报道，TREM2参与了老年痴呆症的发病过程，与编码TREM2的基因上的罕见变异相关。Guerreiro等[11]报道，TREM2在脑组织中广泛表达，在脑白质、海马和新皮层中呈高表达，而在小脑中呈低表达。

认知是机体认识并获得知识的加工过程，主要包括学习、语言、记忆、思维以及精神情感等一系列心理和社会行为。MMSE量表是目前最常用的认知障碍筛查量表，有较高的敏感性和准确性[12]。人类认知功能的形成非常复杂，海马与人类的注意力、记忆力、抽象概括力等认知功能密切相关[13]。本研究采用3.0 T超导磁共振成像技术测量COPD合并认知障碍患者双侧海马总体积，初步研究外周血单核细胞TREM2表达变化与海马总体积变化的关系，为将来此类患者认知障碍的防治提供依据。

本研究结果显示，TREM2 mRNA及蛋白表达量A组

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