p16、Ki67、PHH3和HPV-L1在宫颈脱落细胞中的表达及临床意义

黄平，张雪，陈光元，金瑛

(深圳市宝安区松岗人民医院妇科，广东深圳518105)

p16、Ki67、PHH3和HPV-L1在宫颈脱落细胞中的表达及临床意义

黄平，张雪，陈光元，金瑛

(深圳市宝安区松岗人民医院妇科，广东深圳518105)

目的观察p16基因、Ki67蛋白、核分裂特异性抗体(PHH3)及人乳头瘤病毒L1型(HPV-L1)基因在宫颈病变脱落细胞的表达规律，并探讨其临床意义。方法选取2015年4月至2016年4月期间本院妇科收治的100例妇科病患者作为研究对象，取宫颈脱落细胞，行杂交捕获Ⅱ代法人乳头瘤病毒(HPV HC-Ⅱ)检测和液基薄层细胞学检查，检测并分析HPV-L1、PHH3、Ki67、p16的表达水平。结果宫颈脱落细胞学检出未见上皮内细胞病变(NILM)8例，非典型鳞状上皮细胞/低级别鳞状上皮内病变(ASCUS/LSIL)42例，非典型鳞状上皮细胞不能排除高级别鳞状上皮内病变/高级别鳞状上皮内病变(ASC-H/HSIL)41例，鳞状细胞癌(SCC)9例。ASCUS/LSIL患者的Ki67、PHH3、p16阳性检出率分别为19.05%、4.76%、26.19%，均明显低于ASC-H/HSIL患者的85.37%、88.89%、88.89%，差异均有统计学意义(P＜0.05)；p16阳性表达对宫颈癌及癌前病变的诊断敏感性、特异度分别为90.32% (56/62)、86.84%(33/38)，Ki67分别为83.87%(52/62)、89.47%(34/38)，PHH3分别为70.97%(44/62)、100.00%(38/38)；ASCUS/LSIL患者的HPV-L1阳性表达率为69.05%，明显高于ASC-H/HSIL(0)，差异有显著统计学意义(P＜0.01)。结论PHH3、Ki67、p16联合检测可作为筛查宫颈脱落细胞的辅助手段，其能够有效提高宫颈癌及癌前病变的诊断准确性，检测HPV-L1能够对ASCUS/SLIL病变程度进行有效分流，为临床治疗提供一定的指导。

宫颈脱落细胞；核分裂特异性抗体；人乳头瘤病毒；宫颈癌

宫颈癌是临床发病率较高的一种恶性肿瘤疾病，中国每年的宫颈癌新增病例数约占全球新增病例的29%，每年因宫颈癌死亡的女性超过8万，严重危害着我国女性的生理健康及生命安全[1]。做好宫颈癌及癌前病变筛查，对于改善患者预后，提高患者生活质量具有重大意义。近期不少文献研究都显示，人乳头瘤病毒L1(HPV-L1)蛋白、肿瘤增殖抗原(Ki67)和抑癌基因(p16)、核分裂特异性抗体(PHH3)均与肿瘤的发生、发展有着密切联系[2-3]。本研究旨在明确HPV-L1、Ki67、p16、PHH3表达在宫颈病变筛查中的临床意义，现将结果报道如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料选取我院妇产科2015年4月至2016年4月期间收治的100例行宫颈脱落细胞液基薄层细胞学检查和杂交捕获Ⅱ代法人乳头瘤病毒(HPV HC-Ⅱ)检测的患者。入组标准：患者年龄21～63岁，平均(36.8±4.6)岁；近12个月内未使用过激素药物，未接受过宫颈治疗；完成细胞学和HPV HC-Ⅱ检测后行阴道镜及宫颈活检。

1.2 检测方法

1.2.1 细胞学及HPV HC-Ⅱ检测(1)细胞学检查：将宫颈刷插入患者阴道，在宫颈鳞柱交界顺时针旋转5圈后取出，将取得的宫颈脱落细胞放在保存液中。将取得的宫颈脱落细胞制作成液基薄层涂片，由经验丰富的病理科医师阅片，根据TBS分类法进行细胞学分级。(2)HPV HC-Ⅱ检测：使用采样刷在患者宫颈口顺时针旋转4圈后取出，将采集到的宫颈分泌物放入保存液中，送检。采用HC-Ⅱ法进行HR-HPV DNA检测，检测的DNA型别包括68、59、58、56、52、51、45、39、35、33、31、18、16。其中任意一种类型的HR-HPV DNA结果为阳性，即判定为HR-HPV DNA阳性。

1.2.2 阴道镜检查和病理活检阴道镜检查仪器使用显微定影式光电一体阴道镜，检查过程中注意查看阴道壁情况，对异常部位进行摄片。对阴道壁进行碘染色，在不着色区取宫颈组织2～4块，对于检查未见异常者，分别在宫颈的3点、6点、9点、12点方向取宫颈组织，将取得的宫颈组织送病理科进行病理活检。对宫颈组织进行石蜡包埋、切片，HE染色、阅片。

1.2.3 宫颈脱落细胞免疫组化检查将取得的宫颈脱落细胞液体标本离心后石蜡包埋、切片，采用Envision二步法进行PHH3、Ki67、p16表达检测。磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗为阴性对照，病理检查为宫颈癌的标本为阳性对照。PHH3、Ki67、p16阳性表达均位于细胞核，细胞核呈棕色颗粒染色判定为阳性，无着色判定为阴性。

1.2.4 HPV-L1检测HPV-L1试剂盒由美国爱迪旺斯公司提供，严格按照试剂盒上的说明书进行操作。HPV-L1阳性表达位于细胞核，细胞核呈红色染色判定为阳性。

1.3 统计学方法应用SPSS20.0统计软件进行数据分析，计数资料以百分比(%)表示，组间比较采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 宫颈脱落细胞学诊断与宫颈组织学诊断宫颈脱落细胞学检出未见上皮内细胞病变(NILM)8例，非典型鳞状上皮细胞/低级别鳞状上皮内病变(ASCUS/LSIL)42例，鳞状上皮内病变/高级别鳞状上皮内病变(ASC-H/HSIL)41例，SCC 9例，见表1。

表1 宫颈组织学与脱落细胞学诊断结果(例)

2.2 细胞学检查与免疫标记物表达ASCUS/ LSIL患者的Ki67、PHH3、p16阳性检出率均显著低于ASC-H/HSIL患者，差异有统计学意义(χ2=36.547、32.068、30.123，P均＜0.05)；ASC-H/HSIL与SCC患者的Ki67、PHH3、p16阳性检出率比较差异均无统计学意义(χ2=0.008，0.009及0.112，P＞0.05)，见表2。

表2 细胞学检查与免疫标记物表达比较[例(%)]

2.3 宫颈组织学诊断与免疫标记物表达p16阳性表达对宫颈癌及癌前病变的诊断敏感性、特异度分别为90.32%(56/62)、86.84%(33/38)，Ki67分别为83.87%(52/62)、89.47%(34/38)，PHH3分别为70.97% (44/62)、100.00%(38/38)，见表3。

表3 免疫标记物表达与宫颈组织学诊断结果比较(例)

2.4 细胞学检查与HPV-L1表达宫颈脱落细胞学检查结果异常的92例患者，HPV-DNA检测结果均呈阳性。其中ASCUS/LSIL患者的HPV-L1阳性表达率为69.05%(29/42)，ASC-H/HSIL患者的HPV-L1阳性表达率为19.51%(8/41)，SCC患者的HPV-L1阳性表达率为0。ASCUS/LSIL患者的HPV-L1阳性表达率明显高于ASC-H/HSIL，差异有统计学意义(χ2= 20.606，P＜0.05)。

3 讨论

杂交捕获Ⅱ代法人乳头瘤病毒(HPV HC-Ⅱ)检测与液基薄层细胞学检查是进行宫颈病变筛查的常用手段，但因液基薄层细胞学检查的主观性质明显，检测结果多存在误差。此外，HPV HC-Ⅱ检测无法显示病毒在细胞中存在的状态，所以临床还需寻找一些特异度和敏感度更高的标志物，以提高宫颈病变筛查的准确性[4]。

目前，已有研究证实宫颈癌的发生主要由HPV感染所致，HPV经过长期的进化发展，现已形成了多种类型，按照致病性、功能及结构的不同可将其分为高危型HPV和低危型HPV两大类[5]，而宫颈癌及癌前病变的发生是由高危型HPV持续感染引起的。HPV-L1蛋白是包裹在HPV DNA球心外层的主要衣壳蛋白，其作用为防止DNA受到核酸酶的破坏，保护病毒的致病活性。HPV-L1蛋白能够识别并侵袭宿主细胞的特定部位，HPV附着在宿主细胞上以后，HPV-L1蛋白会协助病毒DNA进入宿主细胞内部[6]。在HPV复制早期，HPV-L1呈阳性表达，而在病毒DNA与宿主细胞DNA整合以后HPV-L1则呈阴性表达，所以检测HPV-L1表达有助于判定HPV感染阶段。本次研究结果显示ASCUS/LSIL患者的HPV-L1阳性表达率明显高于ASC-H/HSIL(P＜0.05)。这一结果与洪玉锋等[7]的文献报道结果相符，说明HPV-L1阳性表达可以作为HPV感染患者良恶性病变的鉴别手段，其能为临床判定患者预后及转归效果提供可靠依据。p16基因是直接参与细胞周期调控功能的抑癌基因，其能对细胞有丝分裂进行负反馈调节。p16在反应性宫颈病变或正常宫颈细胞中呈阴性或微量表达，但其表达会随着宫颈病变程度的加重而升高，可为宫颈癌恶性程度的判定提供依据[8]。PHH3是一种组蛋白H3抗体，具有抗磷酸化特性，其在正常的宫颈细胞中并不表达，只在发生病变的宫颈上皮细胞中表达。同时其表达水平还会随着病变程度的加重而升高，其可作为核分裂标记物对细胞增殖进行定量分析[9]。Ki67蛋白是只存在于细胞核内的多克隆抗体，其与细胞有丝分裂有着密切联系，G0期细胞无Ki67表达，只有G1、S、G2、M期细胞有Ki67表达，并且Ki67会在细胞有丝分裂后期降解，是临床判定肿瘤细胞增殖活性的有效指标[10]。本次研究结果显示p16阳性表达对宫颈癌及癌前病变的诊断敏感性、特异度分别为90.32%、86.84%，Ki67为83.87%、89.47%，PHH3分别为70.97%、100.00%。从研究结果可以看出Ki67、PHH3、p16对宫颈癌及癌前病变的诊断敏感性、特异度均较高，其中PHH3对宫颈癌的诊断特异度最高，提示进行PHH3检测能够有效避免诊断结果的假阴性现象，提高诊断阳性率。

综上所述，PHH3、Ki67、p16对宫颈癌及癌前病变有较高的敏感性和特异性，三者联合检测可作为筛查宫颈脱落细胞有效的辅助手段，能够提高宫颈癌及癌前病变的诊断准确性，检测HPV-L1能够对ASCUS/SLIL病变程度进行有效分流，为临床治疗提供一定的指导。

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Expression and clinical significance of p16,Ki67,PHH3 and HPV-L1 in exfoliated cervical cells.

HUANG Ping,ZHANG Xue,CHEN Guang-yuan,JIN Ying.Department of Gynecology,Songgang People's Hospital of Bao'an District of Shenzhen,Shenzhen 518105,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo observe the expression of p16 gene and Ki67 protein,mitosis-specific antibody anti-phosphohistone-H3(PHH3)and human papilloma virus(HPV)L1 protein(HPV-L1)gene in exfoliated cervical epithelial cells for cervical lesions,and to explore its clinical significance.MethodsA total of 100 patients of gynecological disease in Department of Gynecology from April 2015 to April 2016 were selected as research subjects. The exfoliated cervical cells were collected for high-risk HPV DNA detection by Hybrid CaptureⅡ(HPV HC-Ⅱdetection)and liquid-based cytology(LBC).The expression levels of HPV-L1,PHH3 Ki67 p16 were detected and analyzed.ResultsThere were negative for intraepithelial lesion or malignancy(NILM)in 8 cases,atypical squamous cells/low-grade squamous intraepithelial lesions(ASCUS/LSIL)in 42 cases,atypical squamous cells cannot exclude high-grade squamous intraepithelial lesion/high-grade squamous intraepithelial lesions(ASC-H/HSIL)in 41 cases, and squamous cell carcinoma(SCC)in 9 cases.The positive rates of Ki67,PHH3 and p16 in ASCUS/LSIL patients were 19.05%,4.76%and 26.19%,respectively,which were significantly lower than those of ASC-H/HSIL patients(85.37%, 88.89%,88.89%),and the differences were statistically significant(P＜0.05).The diagnostic sensitivity and specificity for cervical cancer and precancerous lesions were 90.32%(56/62)and 86.84%(33/38)for p16,83.87%(52/62)and 89.47%(34/38)for Ki67,and 70.97%(44/62),100.00%(38/38)for PHH3.The positive expression rate of HPV-L1 in ASCUS/LSIL patients was 69.05%,significantly higher than that ofASC-H/HSIL patients(0),and the difference was statistically significant(P＜0.01).ConclusionPHH3,Ki67,p16 combined detection can serve as auxiliary screening means for exfoliated cervical cells,which can effectively improve the diagnostic accuracy of cervical cancer and precancerous lesions.Detection of HPV-L1 can divert the degree of pathological change of ASCUS/SLIL and provide some guidance for clinical treatment.

Exfoliated cervical cell;Mitosis-specific antibody;Human papillomavirus;Cervical cancer

R711.74

A

1003—6350（2016）21—3464—03

2016-04-23)

黄平。E-mail：youping77731@126.com

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.21.008