Treg/TH17细胞因子的平衡作用与不同中医症候HBV宫内感染相关性研究

栗军香，王银茹，李阿静，郝晓丽，耿静，贾丽霞

（1.河北工程大学附属医院检验科，河北邯郸056002；2.河北工程大学附属医院妇产科，河北邯郸056002；3.邯郸市妇幼保健院功能科，河北邯郸056001；4.涉县人民医院妇产科，河北邯郸056400；5.河北工程大学附属医院药学部，河北邯郸056002；6.河北工程大学医学院生化教研室,河北邯郸056002)

Treg/TH17细胞因子的平衡作用与不同中医症候HBV宫内感染相关性研究

栗军香1，王银茹2，李阿静3，郝晓丽4，耿静5，贾丽霞6

（1.河北工程大学附属医院检验科，河北邯郸056002；2.河北工程大学附属医院妇产科，河北邯郸056002；3.邯郸市妇幼保健院功能科，河北邯郸056001；4.涉县人民医院妇产科，河北邯郸056400；5.河北工程大学附属医院药学部，河北邯郸056002；6.河北工程大学医学院生化教研室,河北邯郸056002)

目的探讨调节性T细胞(Treg)/辅助性T细胞17(Thl7)的平衡作用及其与不同中医症候乙型肝炎病毒(HBV)宫内感染的相关性。方法选择2014年10月至2015年12月期间在河北工程大学附属医院分娩的单胎足月孕妇及其新生儿各100例，根据是否发生HBV宫内感染分为对照组(未发生HBV，n=50)和观察组(发生HBV，n=50)。观察组孕妇根据不同中医症候分为肝郁脾虚型、湿热中阻型、瘀血阻络型、肝肾阴虚型、脾肾阳虚型5组，应用流式细胞仪检测两组孕妇外周血和新生儿脐血Treg细胞和TH17细胞的表达，应用酶联免疫吸附实验(ELISA)法检测两组Treg和TH17相关细胞因子IL-10和IL-17的水平。结果观察组孕妇和新生儿Treg和TH17细胞的表达及IL-10和IL-17水平[孕妇分别为(7.92±1.41)%、(5.64±1.61)%、(316.4±32.3)g/mL、(321.6±30.7)g/mL；新生儿分别为(6.53±1.14)%、(5.11±1.35)%、(298.3±35.4)g/mL、(316.7±28.9)g/mL]均明显高于对照组[孕妇分别为(5.87±1.55)%、(3.19±0.47)%、(153.2±31.5)g/mL、(193.4±21.5)g/mL；新生儿分别为(4.02±1.52)%、(2.98±0.38)%、(141.5±26.1)g/mL、(181.6±23.3)g/mL]，差异均有统计学意义(P＜0.05)；观察组孕妇和新生儿的IL-17/IL-10[(1.01±0.13)、(1.05±0.12)]均小于对照组[(1.31± 0.12、1.30±0.11)]，差异均有统计学意义(P＜0.05)；观察组5种不同中医症候组间IL-17/IL-10比较差异有统计学意义(P＜0.05)，从高到低依次为肝郁脾虚型、湿热中阻型、瘀血阻络型、肝肾阴虚型、脾肾阳虚型[孕妇分别为(1.25±0.16)、(1.11±0.15)、(0.97±0.14)、(0.83±0.14)、(0.69±0.1)；新生儿分别为(1.22±0.15)、(1.03±0.16)、(0.93±0.15)、(0.81±0.13)、(0.64±0.15)]。结论发生HBV宫内感染的孕妇和新生儿Treg细胞和TH17细胞及其相关细胞因子的表达均增强，Treg细胞的增幅高于TH17细胞，IL-17/IL-10细胞因子的免疫失衡可能是引起HBV宫内感染的因素之一。

Treg细胞；TH17细胞；不同中医症候；乙型肝炎病毒；宫内感染

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)属于一种嗜肝DNA病毒,是目前全球最常见也是危害最严重的传染性疾病。我国是乙肝大国,HBV感染率高,并极易引起肝硬化、肝癌等严重并发症[1]，对HBV感染的有效预防和治疗是一个公认的难题。母婴垂直传播是HBV感染传播的主要途径之一，其中以宫内感染常见,而目前有关HBV宫内感染的机制尚不明确。近年研究发现，Treg细胞和Thl7细胞可调节机体的免疫平衡作用，Treg细胞具有免疫抑制作用,Thl7细胞具有促进炎症反应作用，二者平衡的破坏与多种疾病的发生发展有关[2]。而中医理论认为疾病的发生发展是正邪双方的失衡所致，因此，认为机体免疫细胞和细胞因子的功能强弱可能与HBV宫内感染的不同中医辨证分型有关，故本研究通过研究孕妇及其新生儿Treg/ TH17细胞因子的平衡作用，探讨HBV宫内感染的发生机制，寻找降低宫内感染的新方向，并为其中医辨证分型提供一定指导。

1 资料与方法

1.1 一般资料选择2014年10月至2015年12月期间在河北工程大学附属医院行产前检查和分娩的单胎足月孕妇及其新生儿各100例作为研究对象，按照是否发生HBV宫内感染分为观察组和对照组，观察组50例孕妇及其新生儿发生HBV宫内感染，对照组50例孕妇及其新生儿未发生HBV宫内感染。所有孕妇经检测均为HBsAg阳性，但肝功正常。排除具有先兆流产或早产史者；有病原体感染史及其他妊娠合并症者；近期服用抗病毒或激素药物者；患有其他病毒性肝炎或非病毒性肝炎及严重全身疾患者；排除胎儿先天畸形和配偶HBV携带者。对出生新生儿的脐带血进行检测，以HBsAg阳性和(或)HBV-DNA阳性确定为发生HBV宫内感染。其中观察组新生儿中大三阳(HBsAg+、HBeAg+、HBcAb+)21例，小三阳(HBsAg+、HBeAb+、HBcAb+)29例，对照组新生儿中大三阳20例，小三阳30例。两组孕妇的年龄、孕周、孕次、分娩方式及新生儿性别比较差异均无统计学意义(P＞0.05)，具有可比性。

1.2 研究方法

1.2.1 样本采集采集所有孕妇空腹静脉血2管，3 mL/管，其中1管于24 h内进行检测Treg细胞和TH17细胞的表达，另1管以3 000 r/min，离心10 min，将上清置于EP管中，-80℃保存，以进行IL-10和IL-17水平检测。新生儿脐带结扎切断后,抽取脐静脉血三管,每管3 mL，进行乙肝五项及HBV-DNA、Treg细胞和TH17细胞、IL-10和IL-17水平的检测。

1.2.2 检测方法新生儿脐血乙肝五项测定采用全自动化学发光分析仪应用ELISA法进行定量测定，检测试剂购自武汉众生生物工程有限公司；采用荧光定量PCR法进行脐血HBV-DNA的检测，试剂购自珠海赛乐奇生物技术公司；采用美国BD流式细胞仪应用流式细胞技术测定孕妇血和脐血Treg细胞和TH17细胞表达；应用ELISA法测定孕妇血和脐血IL-10和IL-17。均严格按说明书操作。

1.3 中医症型分型标准参考中国中医药学会内科肝病专业委员会1991年天津会议制定的《病毒性肝炎中医辨证标准》,将观察组孕妇及其新生儿分为湿热中阻型、肝郁脾虚型、肝肾阴虚型、脾肾阳虚型和瘀血阻络型5种证候,每组10例。

1.4 统计学方法应用SPSS19.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差(±s)表示,组间比较采用t检验，不同中医症型的多组间比较采用方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组孕妇和新生儿Treg细胞和TH17细胞表达与对照组比较,观察组孕妇外周血和新生儿脐血Treg细胞和TH17细胞所占CD4+淋巴细胞的比例均明显升高，差异均有统计学意义(P＜0.01)，见表1。

2.2 两组孕妇和新生儿IL-10和IL-17水平比较观察组孕妇和新生儿IL-10和IL-17的水平均明显高于对照组，而IL-17/IL-10比值则明显低于对照组，差异均有统计学意义(P＜0.01)，见表2。

表1 两组孕妇和新生儿Treg细胞和TH17细胞的表达比较(±s,%)

表1 两组孕妇和新生儿Treg细胞和TH17细胞的表达比较(±s,%)

组别孕妇新生儿Treg细胞TH17细胞Treg细胞TH17细胞观察组(n=50)对照组(n=50) t值P值7.92±1.41 5.87±1.55 6.917＜0.01 5.64±1.61 3.19±0.47 10.329＜0.01 6.53±1.14 4.02±1.52 9.341＜0.01 5.11±1.35 2.98±0.38 10.739＜0.01

2.3 不同中医症型孕妇和新生儿IL-10和IL-17水平比较5种不同中医症候HBV宫内感染的孕妇和新生儿的IL-17/IL-10存在差异具有统计学意义，IL-17/IL-10比值从高到低依次为肝郁脾虚型、湿热中阻型、瘀血阻络型、肝肾阴虚型、脾肾阳虚型(P＜0.05)，见表3。

表2 两组孕妇和新生儿IL-10和IL-17的水平比较(±s)

表2 两组孕妇和新生儿IL-10和IL-17的水平比较(±s)

组别孕妇新生儿观察组(n=50)对照组(n=50) t值P值IL-10(pg/mL) 316.4±32.3 153.2±31.5 25.578＜0.01 IL-17(pg/mL) 321.6±30.7 193.4±21.5 24.187＜0.01 IL-17/IL-10 1.01±0.13 1.31±0.12 11.980＜0.01 IL-10(pg/mL) 298.3±35.4 141.5±26.1 25.209＜0.01 IL-17(pg/mL) 316.7±28.9 181.6±23.3 25.734＜0.01 IL-17/IL-10 1.05±0.12 1.30±0.11 10.859＜0.01

表3 不同中医症型孕妇和新生儿IL-10和IL-17的水平比较(±s)

表3 不同中医症型孕妇和新生儿IL-10和IL-17的水平比较(±s)

注：与对照组比较，aP＜0.05；与肝郁脾虚型组比较，bP＜0.05；与湿热中阻型比较，cP＜0.05；与瘀血阻络型比较，dP＜0.05；与肝肾阴虚型比较，eP＜0.05。

组别孕妇新生儿IL-10(pg/mL)IL-17(pg/mL)IL-17/IL-10IL-10(pg/mL)IL-17(pg/mL)IL-17/IL-10观察组湿热中阻(n=10)肝郁脾虚(n=10)肝肾阴虚(n=10)脾肾阳虚(n=10)瘀血阻络(n=10)对照组(n=50) F值P值1.03±0.16abd1.22±0.15abd0.81±0.13abcd0.64±0.15abcde0.93±0.15abc1.30±0.11 21.877＜0.001 321.2±30.6 301.8±29.4 366.5±34.2 382.6±35.1 351.3±32.7 153.2±31.5 10.309＜0.001 356.5±33.4 375.9±36.2 304.2±30.4 262.1±30.5 341.2±31.8 193.4±21.5 19.347＜0.001 1.11±0.15abd1.25±0.16acd0.83±0.14abcd0.69±0.17abcde0.97±0.14abc1.31±0.12 21.084＜0.001 330.9±29.8 315.2±28.5 359.3±32.8 376.1±34.2 344.7±30.6 141.5±26.1 5.782＜0.001 341.7±33.9 384.2±34.1 291.4±30.3 241.7±28.6 320.5±32.4 181.6±23.3 28.094＜0.001

3 讨论

人体感染HBV后,通过特定的免疫反应，产生T细胞介导的细胞毒作用或免疫复合物作用而造成机体细胞损害[3]。目前，西医辨病和中医辨证相结合是临床对乙肝诊治的一种新的思维方法，且逐渐成为一种发展趋势。中医认为慢性乙肝的病因主要是外感湿热疫毒和内因正气亏虚，正气亏虚不胜邪，致使疾病发生，日久损伤气血脏腑，使机体出现气血阴阳不和，而导致脾虚、肝郁、气滞及血瘀[4]。HBV宫内感染是指乙肝或乙肝携带者的孕妇在围产期通过母婴途径将HBV传播给胎儿，这与中医的“胎毒”学说相一致。

中医中的正气与现代医学的抵抗力类似，如正气盛机体抵御外邪的能力强，不易发病；而正气亏则机体对外邪的防御能力就弱，湿热疫毒乘虚侵入而致发病。因此,人体免疫功能强弱与中医正气盛衰、辨证分型存在相关性[5]。目前虽然临床工作者不断研究探讨,中医对HBV感染的辨证分型还缺乏统一的标准，有五种症型和六种症型两种，以五种症型标准较多。而1991年的辨证分型标准是目前被广泛接受和使用较多的标准[6]，本研究也是参考该标准对HBV宫内感染进行的中医辨证分型。因此，进一步研究HBV宫内感染的免疫细胞特点及与中医证型的相关性，可以对HBV感染的辨证分型提供客观的和量化的指标和指导价值。

大量研究表明Th1/Th2细胞系统的免疫平衡紊乱是HBV宫内感染发生的可能机制之一[7]。近年，发现CD4+T淋巴细胞系统的另外两种细胞即Treg/TH17细胞的免疫失衡参与了多种疾病的发生发展[8]。Treg为具有抗炎作用的调节性T细胞，IL-10、TGF-βI是其发挥免疫作用的主要细胞因子；TH17为具有促炎作用的辅助性T细胞，IL-17是其主要的效应细胞因子，参与多种慢性疾病的发生。当机体正常状态时，Treg/ TH17细胞系统之间存在着一个动态平衡；当机体伴有炎症时，IL-6会诱导Th17细胞的分化，导致前炎症反应[9]。本研究结果显示观察组孕妇外周血和新生儿脐血Treg细胞和TH17细胞所占CD4+淋巴细胞的比例均明显高于对照组，IL-10和IL-17的水平均显著高于对照组,而IL-17/IL-10比值显著低于对照组,说明发生HBV宫内感染的孕妇和新生儿Treg细胞和TH17细胞均表达增强，其相关细胞因子水平也上升。IL-17/IL-10比值降低，说明两种细胞之间存在着一定的负反馈调节机制，在HBV的感染过程中,随着Treg细胞的高表达则会抑制Thl7细胞亚群的增殖，从而造成Treg/TH17细胞的免疫失衡，会进一步加重疾病的进展[10]。本研究显示5种中医证型的HBV宫内感染孕妇和新生儿的IL-17/IL-10比值也有显著差异，以脾肾阳虚证IL-17/IL-10的失衡最严重，而该症型患者的病程最长，病情也最重。

综上所述，Treg/TH17细胞因子的免疫失衡可能参与HBV宫内感染的发生，IL-17/IL-10的失衡可能是HBV宫内感染发生的危险因素之一。Treg/TH17细胞因子的平衡作用与不同中医证型的HBV宫内感染存在一定相关性，可指导HBV感染的中医辨证分型，同时可进一步研究如何通过降低孕妇体内Treg细胞表达来降低HBV宫内感染的发生率。

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Relationship between the balance of Treg/TH17 cytokines and the intrauterine infection of HBV in different TCM syndromes.

LI Jun-xiang1,WANG Yin-ru2,LI A-jing3,HAO Xiao-li4,GENG Jing5,JIA Li-xia6.1.Department of Clinical Laboratory,the Affiliated Hospital of Hebei University of Engineering,Handan 056002,Hebei,CHINA; 2.Department of Obstetrics and Gynecology,the Affiliated Hospital of Hebei University of Engineering,Handan 056002, Hebei,CHINA;3.Department of Function,Handan Maternal and Child Health-Care Hospital,Handan 056001,Hebei, CHINA;4.Department of Obstetrics and Gynecology,Shexian County People's Hospital,Handan 056400,Hebei,CHINA; 5.Department of Pharmacy,the Affiliated Hospital of Hebei University of Engineering,Handan 056002,Hebei,CHINA; 6.Department of Biochemistry,Faculty of Medicine of Hebei University of Engineering,Handan 056002,Hebei,CHINA

ObjectiveTo investigate the role of regulatory T cells(Treg)/helper T cell 17(Thl7)and its correlation with the intrauterine infection of hepatitis B virus(HBV)in different traditional Chinese medicines(TCM)syndromes.MethodsA total of 100 single fetus full-term pregnant women and their newborns coming from Affiliated Hospital of Hebei University of Engineering from October 2010 to December 2015 were divided into the control group (n=50)and observation group(n=50)according to whether the occurrence of HBV intrauterine infection.The observation group was divided into liver and spleen deficiency type,damp heat resistance type,blood stasis type,liver and kidney deficiency type,spleen and kidney yang deficiency type 5 groups according to different TCM syndrome.The expression of Treg cells and TH17 cells in peripheral blood of pregnant women and umbilical cord blood of were detected by flow cytometry,and enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)was used to detect the level of cytokines IL-10 and IL-17 that related to TH17 and Treg in the two groups.ResultsThe expression of Treg and TH17 cells and the levels of IL-10 and IL-17 of pregnant women and newborn in the observation group were(7.92±1.41)%,(5.64±1.61)%, (316.4±32.3)g/mL,(321.6±30.7)g/mL,(6.53±1.14)%,(5.11±1.35)%,(298.3±35.4)g/mL,(316.7±28.9)g/mL,respectively,which were significantly higher than these of pregnant women and newborn in the control group of(5.87±1.55)%,(3.19±0.47)%,(153.2±31.5)g/mL,(193.4±21.5)g/mL,(4.02±1.52)%,(2.98±0.38)%,(141.5±26.1)g/mL,(181.6±23.3)g/mL respectively,with statistically significant differences(P＜0.05).The IL-17/IL-10 of pregnant women and newborn in the observation group were significantly lower than control group,and the difference was statistically significant(P＜0.05). The IL-17/IL-10 of pregnant women and newborn in the observation group were(1.01±0.13),(1.05±0.12)respectively, which were significantly lower than those in the observation group of(1.31±0.12),(1.30±0.11),P＜0.05.The IL-17/ IL-10 of five different TCM syndrome group in the observation group were significantly different(P＜0.05),from high to low,followed by liver and spleen deficiency type,damp heat resistance type,blood stasis type,liver and kidney deficiency type,spleen and kidney yang deficiency type.The IL-17/IL-10 of five different TCM syndrome group in pregnant women were(1.25±0.16),(1.11±0.15),(0.97±0.14),(0.83±0.14),(0.69±0.1),respectively,which were respectively (1.22±0.15),(1.03±0.16),(0.93±0.15),(0.81±0.13)and(0.64±0.15)in newborn.ConclusionThe expression of Treg and TH17 cells and the levels of associated cytokines in pregnant women and newborns with HBV intrauterine infection are increasing,and Treg cells is higher than TH17 cells,the immune imbalance of IL-17/IL-10 probably one of the factors of HBV intrauterine infection.

Treg cell;TH17 cell;Different traditional Chinese medicine syndrome;Hepatitis B virus(HBV);Intrauterine infection

R512.6+2

A

1003—6350（2016）21—3448—04

2016-04-25)

河北省邯郸市科技局项目(编号：0823108061-3)

栗军香。E-mail：lijunxiang11235@163.com

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.21.003