HPV E6/E7 mRNA和HPV DNA作为宫颈癌筛查分子标记物的比较研究

王娟，杨岚，崔彬，王丽峰，文清华，徐兰兰，吴福清

（湛江廉江市人民医院妇产科1、检验科2，广东湛江524400）

HPV E6/E7 mRNA和HPV DNA作为宫颈癌筛查分子标记物的比较研究

王娟1，杨岚1，崔彬1，王丽峰1，文清华1，徐兰兰1，吴福清2

（湛江廉江市人民医院妇产科1、检验科2，广东湛江524400）

目的探讨人乳头瘤病毒(HPV)DNA和HPV E6/E7 mRNA的两种检测标记物在宫颈癌筛查中的应用价值。方法选取2014年1月至2016年1月湛江廉江市人民医院妇产科收治的406例宫颈癌患者为研究对象，采用超薄液基细胞学检查(TCT)作为金标准。采用PCR法检测所有患者的HPV DNA和HPV E6/E7 mRNA，并评价两种标记物对宫颈癌诊断的敏感性和特异性。结果406例患者中HPV DNA阳性率为47%(191/406)，而HPV E6/E7 mRNA检测阳性率为31.2%(127/406)，两者比较差异有统计学意义(P＜0.05)；两种检测标记物所得结果的符合率为85.5%；在CIN1标本中，HPV DNA检测的敏感度和特异度分别为88.6%、75.8%，与HPV E6/E7 mRNA检测的86.9%、73.4%比较差异均无统计学意义(P＞0.05)；在CIN2标本中，HPV E6/E7 mRNA检测的特异性为90.5%，高于HPV DNA的79.8%，差异有统计学意义(P＜0.05)，但是敏感性为83.9%，明显低于HPV DNA的93.7%，差异有统计学意义(P＜0.05)；在CIN3标本中，HPV mRNA检测的敏感度和特异性分别为98.7%、85.9%，均高于HPV DNA的89.1%、78.8%，差异均有统计学意义(P＜0.05)。结论检测HPV mRNA在宫颈癌患者的诊断方面比检测HPV DNA更具有优势。

人乳头瘤病毒；E6/E7 mRNA；宫颈癌；筛查；分子标记物

宫颈癌是妇产科常见的肿瘤疾病之一，随着对宫颈癌早期筛查的开展，其发病率和病死率得到明显的改善[1]。然而，宫颈癌仍然是妇女发病和死亡的最常见恶性疾病[2]。人乳头瘤病毒(human papilloma virus，HPV)属于乳多空病毒科乳头瘤空泡病毒A属球形DNA病毒，其与宫颈癌有密切关联，必须早期诊断及重视[3]。HPV最常见的基因型为HPV16、18、31、33和45[4]。在宫颈癌检测中，宫颈涂片的细胞学检测已得到广泛的应用，但是它并不是宫颈癌筛查的理想方法。随着表观遗传学与精准医学的发展，HPV病毒DNA检测在宫颈癌筛查中已有较大的改善，但其阳性预测率和特异性仍然偏低。研究表明HPV的感染是瞬时事件，通常不需要治疗就可在6～24个月后自动清除，因此可能出现假阳性的结果[5]。而在病毒表达方面，研究则认为长期反复感染与HPV E6/E7密切相关[6]。与HPV DNA的检测不同，对病毒RNA的检测可以检测有转录活性的病毒。因此，作为受感染细胞中E6/E7癌基因持续表达的标志，HPV E6/E7 mRNA可能成为有意义的肿瘤标志物[7]，是目前宫颈癌风险评估的重要参考指标之一[8]。本研究通过比较HPV DNA检测与HPV E6/E7 mRNA检测在宫颈癌患者中的特异性和敏感性，为宫颈癌的临床筛查提供更有效的手段。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2014年1月至2016年1月湛江市廉江人民医院妇产科收治的406例重度宫颈炎患者。纳入标准：宫颈炎，分级为重度，伴见宫颈糜烂、接触性出血、宫颈肿物等，尚未经系统治疗，知情同意取宫颈脱落细胞及宫颈活检组织。患者平均年龄(40.1±10.8)岁。按照Bethesda系统分类标准，其中正常为未见病变细胞(NILM，258例)，异常为非典型鳞状细胞(ASCUS，26例)、低度鳞状上皮内病变(LSIL，81例)、高度鳞状上皮内病变(HSIL，41例)。以病理检查报告为金标准，组织学采用Richart标准分级：CIN1 (85例)、CIN2(267例)、CIN3(54例)，分别指轻、中、重度宫颈鳞状上皮非典型增生。按照浸润情况分类，超过1/2的有283例，小于1/2的有123例。

1.2 实验方法

1.2.1 临床标本收集所有患者行宫颈超薄液基细胞学检查(thin prep liquid-based cytology test，TCT)，阴道镜下活检组织进行病理学检查。TCT取材采用活检刷拭法，在宫颈管内和鳞住上皮交界处采集细胞后刷洗在TCT保存液中。

1.2.2 RNA提取采用TRI裂解液(购自Sigma公司)进行常规裂解。使用微量移液器吹打使之裂解充分并混匀。加入氯仿200 μL，水平振荡器匀速振荡15 s。预冷离心机至4°C，待室温平衡3 min后置于低温高速离心机离心(Thermo公司)，条件为12 000 r/min，离心15 min。取400 μL水相并加入异丙醇500 μL，充分混匀；低温高速离心机离心15 min，条件为12 000 r/min，弃上清；加入70%乙醇溶液1 000 μL洗涤；4°C，7 500 r/min，低温高速离心机离心5 min，弃上清。沉淀风干3～5 min后加入焦碳酸二乙酯处理水40 μL溶解RNA沉淀，测定RNA浓度和完整性，-70°C保存。

1.2.3 HPV E6/E7 mRNA检测按照说明书进行常规预处理，利用宫颈稳态检测试剂盒进行测试，通过配套计算软件自动读取HPV E6/E7 mRNA拷贝数值。HPV RNA阳性判断标准为检测样本的平均拷贝数值＞1.0。

1.2.4 HPV DNA检测采用PCR反向点杂交法对人乳头瘤病毒HPV基因分型进行检测(试剂盒购自杭州美联生物科技有限公司)。按照试剂盒说明书对上述标本进行HPV检测及基因分型。

1.3 统计学方法应用SPSS19.0统计软件进行数据分析，计量数据以均数±标准差(±s)表示，组间比较采用独立两样本t检验(方差不齐采用校正t检验)，计数资料采用Pearsonχ2检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 两种检测标记物阳性率比较406例宫颈癌患者中191例HPV DNA检测阳性，占47.0%，127例HPV E6/E7 mRNA检测阳性，占31.2%，两组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。两种标记物检测的总体符合率为85.5%，其中两种标记物检测均呈阳性者204例，均为阴性144例。有59例检测结果不一致(14.5%)，见表1。在HPV DNA阳性患者中，HPV mRNA阳性的病理分型分布为NILM占19.6%，ASCUS占41.2%，LSIL占45.9%，HSIL占83.7%，结果见图1。病理分级分布为CIN1占63.6%，CIN2占85.7%，CIN3占100%，见图2。

表1 两种检测标记物阳性率较比(n=406)

2.2 两种检测标记物的诊断符合率比较在CIN1标本中，HPV DNA检测的敏感度为88.6%，特异度75.8%，而HPV mRNA检测的敏感度为86.9%，特异度为73.4%。在CIN2的标本中HPV DNA检测的敏感度为93.7%，特异度为79.8%，而HPV mRNA检测的敏感度为83.9%，特异度为90.5%。在CIN3标本中，HPV DNA检测的敏感度为85.9%，特异度为78.8%，而HPV mRNA检测的敏感度为98.7%，特异度为89.4%。两种检测标记物对CIN1标本检测的敏感度与特异度比较差异均无统计学意义(χ2=0.05，敏感度= 0.83；χ2=0.10，特异度=0.75)。在对CIN2标本的检测中，HPV mRNA检测的特异度高于HPV DNA(χ2=4.89，P= 0.03)，而敏感度比HPV DNA稍差(χ2=4.74，P=0.03)。在对CIN3标本的检测中，HPV mRNA检测的敏感度和特异性均高于对HPV DNA的检测，差异均有统计学意义(χ2=9.78，敏感度=0.00；χ2=4.39，特异度=0.04)。

图1 HPV DNA阳性患者中HPV mRNA阳性的病理分型分布

图2 HPV DNA阳性患者中HPV mRNA阳性的病理分级分布

3 讨论

3.1 宫颈癌及目前临床常用的筛查方法宫颈癌是一高发的妇科肿瘤,虽然在发达国家中已经成功的降低了宫劲癌的死亡率，在其早期预防阶段推行更加敏感和更加具体的方法学仍然存在着挑战。流行病学统计学研究表明，宫颈癌死亡率较高，每年约有50万的妇女因其去世，对家庭和社会带来严重的健康威胁。再者，人乳头瘤病毒感染也被认定为宫颈癌的主要病因之一，早期筛查有助于宫颈癌的防治与转归[9]。因此，临床迫切需要新型特异性生物标记物来实现诊断与干预。当前HPV的分子诊断方法主要依赖于对HPV DNA标记物检测。有研究认为，HPV DNA标记物检测是病因学依据，不能判断出宫颈感染的具体阶段以及癌基因的活性程度[10]。相对来说，HPV E6/E7标记物则可在宫颈癌组织中表现为癌基因活性，同时HPV E6/E7标记物水平与病变的严重程度有关[11]。再者，研究还发现高危型HPV癌基因E6和E7对于恶性肿瘤的转化和维持具有重要作用，因而检测HPV E6和E7标记物得到越来越多的关注。

目前，最常用的筛查方法包括宫颈刮片检查。基于重复的细胞学检测，将追踪患者异常的细胞形态切片作为指标，HPV DNA标记物检测以及阴道镜检测[1]。在筛查子宫颈癌中，细胞形态学的低敏感性以及HPV DNA标记物检测的特异性都需要提高，并且采用更加特异的方法进行演算，而不是采用细胞形态学和HPV DNA标记物检测，尤其对于年轻的群体(21～29岁)来说，因为这一群体不建议采用HPV DNA检测。对于区分暂时性和永久性感染，DNA检测不足以提供信息。这种检测标记物赋予了全面诊断和全局治疗暂时性感染的风险。检测HPV原癌基因的活性而不是检测HPV DNA的存在是一种更加相关的诊断宫颈癌病变以及宫颈癌的指标。它能够提供临床上的预测标志，以区分女性存在发展为高级别的宫颈不典型增生病变或者宫颈癌的风险。并且在评估女性轻微宫颈病变中，对于检测HPV DNA的存在，检测其活性可以用来作为更加特异的指标。为了提高筛查的程序，建立更好的特异性，基于HPV mRNA的检测方法学。

3.2 HPV DNA和E6/E7 mRNA检测标记物与宫颈病变程度HPV基因组中E6/E7基因是病毒原癌基因，病毒DNA一旦整合进入宿主细胞DNA中，E6/E7基因将不受控制地高度表达。E6/E7 mRNA表达是宫颈癌发生发展的必经步骤。随着宫颈病变的加重，HPV E6/E7 mRNA检测的阳性率也随之增加。张生枝等[10]的对CIN2宫颈病变患者的研究发现，HPV E6/ E7 mRNA特异度高于HPV DNA，通过ROC曲线分析，其准确性也高于HPV DNA。但HPV DNA的灵敏度不够高，导致漏诊风险的存在。

3.3 两种标记物的敏感性和特异性本研究分别采用HPV DNA和E6/E7 mRNA检测两种标记物对406例患者标本进行了比较研究。研究结果表明，HPV DNA检测的阳性率(47%)高于HPV E6/E7 mRNA检测(31.2%)。本研究采用组织病理学标准作为诊断的金标准。在CIN1分级标本中，HPV DNA检测的敏感度与特异度与HPV mRNA检测的敏感度和特异性上没有差异。在CIN2分级标本的检测中，HPV mRNA检测的特异性高于HPV DNA检测，但是敏感性比HPV DNA检测低。在对CIN3分级标本的检测中，HPV mRNA检测的敏感度和特异性都高于对HPV DNA的检测。这与张生枝等[10]的研究结果相一致。上述研究结果表明，HPV mRNA检测在对宫颈癌患者的诊断方面比HPV DNA检测更具有优势，可以显著减少假阴性结果。因此HPV E6/E7 mRNA检测在临床上对宫颈病变的检测与诊断中具有广阔的应用前景，加之PCR技术日渐成熟，其具有检测时间少，靶点精确和技术先进的特点，HPV E6/E7 mRNA检测未来可能成为宫颈癌筛查的重要辅助诊断指标与手段。

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Comparative study of HPV E6/E7 mRNA and HPV DNA biomarker in the diagnosis of cervical carcinoma.

WANG Juan1,YANG Lan1,CUI Bing1,WANG Li-feng1,WEN Qing-hua1,XU Lan-lan1,WU Fu-qing2.Department of Obstetrics and Gynecology1,Department of Laboratory2,the People's Hospital of Lianjiang City,Zhanjiang 524400,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo explore the application value of two biomarkers of HPV E6/E7 mRNA and HPV DNA in the screening diagnosis of cervical carcinoma.MethodsA total of 406 patients with cervical carcinoma, who admitted to Department of Obstetrics and Gynecology of the People's Hospital of Lianjiang City from January 2014 to January 2016,were selected as the research objects.Human papillomavirus(HPV)E6/E7 mRNA and HPV DNA were detected by polymerase chain reaction(PCR)in all patients,and the sensitivity and specificity of the two markers for cervical intraepithelial neoplasia diagnosis were evaluated and compared by ThinPrep liquid based cytology(TCT).ResultsThe positive rate of HPV DNA and E6/E7 mRNA test were 47%(191/406)and 31.2%(127/406), respectively(P＜0.05).The overall coincidence rate of the two markers was 85.5%.There were no significant difference between HPV DNA and E6/E7 mRNA test in sensitivity and specificity for detecting CIN1(88.6%vs 86.9%,75.8%vs 73.4%,P＞0.05).There were significant differences between HPV DNA and E6/E7 mRNA test in sensitivity and specificity for detecting CIN2(93.7%vs 83.9%,P＜0.05;79.8%vs 93.7%,P＜0.05).The sensitivity and specificity of HPV E6/E7 mRNA assay(98.7%,85.9%,respectively)were significantly higher than those of HPV DNA test(89.1%,78.8%,respectively)for detecting CIN3(P＜0.05).ConclusionIn the screening diagnosis of HPV of cervical carcinoma,HPV E6/E7 mRNAtest has significantly higher specificity and sensitivity than HPV DNAtest.

Human papillomavirus(HPV);E6/E7 mRNA;Cervical carcinoma;Screening,Biomarker

R737.33

A

1003—6350（2016）21—3458—04

2016-05-25)

广东省湛江市非资助科技攻关计划项目(编号：2014B101)

王娟。E-mail：13610188703@qq.com

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.21.006