大蒜素联合5-FU对腺样囊性癌ACC-M裸鼠移植瘤的抑制作用

车超，吴发印，李华林，周鹤峰

(1.遵义医学院第五附属珠海医院口腔科，广东珠海519100；2.遵义医学院珠海校区生物工程系，广东珠海519041)

·论著·

大蒜素联合5-FU对腺样囊性癌ACC-M裸鼠移植瘤的抑制作用

车超1，吴发印1，李华林1，周鹤峰2

(1.遵义医学院第五附属珠海医院口腔科，广东珠海519100；2.遵义医学院珠海校区生物工程系，广东珠海519041)

目的探讨大蒜素联合5-FU对腺样囊性癌ACC-M裸鼠移植瘤的抑制作用。方法建立ACC-M细胞Balb/c裸鼠肩胛下移植瘤模型30只。造模2周后挑选24只肿瘤大小较均匀的裸鼠随机分为实验组(大蒜素组、5-FU组和大蒜素联合5-FU组)和对照组，各6只。实验组按照体质量0.01 mL/g腹腔注射大蒜素和5-FU浓度均为20 μg/mL，对照组注射0.9%PBS液，每两天一次，共3次，末次注射1周后处死动物。测量移植瘤的体积变化，HE染色观察移植瘤的病理学改变。结果移植瘤体积变化比较结果：各实验组移植瘤体积明显缩小，5-FU组体积小于大蒜素组，大蒜素联合5-FU组与大蒜素组、5-FU组比较差异有显著统计学意义(P＜0.01)；镜下见对照组的癌细胞生长旺盛，异型率高，而各实验组的肿瘤细胞出现不同程度减少，间质增加，大蒜素联合5-FU组最为明显。结论大蒜素和5-FU均能有效抑制ACC-M细胞Balb/c裸鼠移植瘤的生长，且大蒜素联合5-FU的抑制作用明显强于大蒜素或5-FU单独使用。

大蒜素；5-FU；腺样囊性癌；裸鼠；移植瘤

腺样囊性癌(adenoid cystic carcinoma，ACC)一般发生在口腔颌面部的唾液腺组织中，是一种易复发、易沿神经扩散以及易发生远处转移的恶性肿瘤，其对放疗和化疗的敏感性较低，具有较高的死亡率[1]。常用的化疗药物有5-FU、长春新碱、紫杉醇等，但其对腺样囊性癌的治疗有效率不高，且容易发生耐药性[2]。近年来的研究表明，大蒜素对各种癌症具有明显的抑制作用，已成为近期抗癌研究的热点[3-6]，且已有研究表明大蒜素和大蒜油均对体外培养的腺样囊性癌细胞系(ACC-M)具有抑制作用[7-8]。因此大蒜素作为辅助化疗药物既可减轻单纯化疗药物对于正常细胞的杀伤，又可增强化疗药物的药学作用。本研究通过建立ACC-M细胞Balb/c裸鼠皮下移植瘤模型，探讨大蒜素联合5-FU对腺样囊性癌的抑制作用，为进一步拓展其临床应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与实验动物人腺样囊性癌ACC-M细胞系由武汉大学保藏中心提供；大蒜素注射液和5-FU分别由广州皖冬生物科技有限公司和上海旭东海普药业有限公司生产；胎牛血清及DMEM细胞培养液购自凯基公司；BALB/c-nude T淋巴细胞缺陷型小鼠购自北京华阜康生物科技股份有限公司。所购30只裸鼠均为雌性，5～6周龄，体质量(18±2)g，健康状况良好，动物合格证号为No.11401300035243。将其饲养在常规SPF级管理的华中科技大学实验动物中心的无菌密闭笼具中，确保笼具独立通风，室温为18℃～22℃，湿度为50%～80%。

1.2 裸鼠异种移植与药物干预方式

1.2.1 细胞培养人腺样囊性癌ACC-M细胞使用含有100 U/mL链霉素、100 U/mL青霉素及10%小牛血清的DMEM培养基，在37°C以及含有5%CO2的条件下培养，2～3 d传代1次。对数生长期的细胞使用胰酶消化后用培养基终止消化，PBS液洗涤、离心、去除上清，收集细胞。用PBS缓冲液调整细胞浓度为约2×107个活细胞/mL的细胞悬液备用(使用台盼蓝染色确保细胞活力不低于95%)。

1.2.2 裸鼠造模将所购裸鼠饲养1周以适应实验环境，取前述细胞悬液无菌条件下在30只裸鼠右前肩胛下进行皮下注射接种，每只0.2 mL。接种后2周可见肿瘤生长，呈结节性、膨胀性生长，质硬。

1.2.3 模型分组与药物干预造模2周后挑选24只肿瘤大小较均匀的裸鼠随机分为4组(对照组、大蒜素组、5-FU组和大蒜素联合5-FU组)，每组6只。对照组注射0.9%PBS，实验组注射的大蒜素和5-FU浓度均为20 μg/mL，每只裸鼠按照体重腹腔注射药物0.01 mL/g，每2 d注射一次，共注射3次。末次注射一周后拉颈处死裸鼠，取出完整肿瘤组织。

1.3 计算瘤体积给药前及末次给药后1周，用游标卡尺测量瘤体长径(a)和短径(b)以计算瘤体积(tumor volume，TV)：TV=ab²/2。

1.4 抑瘤率抑瘤率=(1-实验组平均瘤体积/对照组平均瘤体积)×100%。抑瘤率＞40%说明有抑制作用。

1.5 HE染色组织病理学观察将手术分离的肿瘤组织以10%甲醛固定，24 h后进行石蜡包埋，4 μm连续切片，HE染色，在光镜下观察各组肿瘤组织的形态结构变化。

1.6 统计学方法所有数据用SPSS17.0统计软件包处理。采用均数±标准差(±s)表示移植瘤体积，抑瘤率以百分比表示，组间两两比较采用方差分析，校验水准：α=0.05，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 计算平均瘤体积和抑瘤率第一次给药前(TV1)对照组、大蒜素组、5-FU组、大蒜素联合5-FU组的平均瘤体积比较，差异无统计学意义(P=0.161＞0.05)。末次给药后，1周大蒜素组、5-FU组、大蒜素联合5-FU组平均瘤体积明显小于对照组(P＜0.01)；联合用药组小于大蒜素组(P＜0.01)、小于5-FU组(P＜0.05)；5-FU组小于大蒜素组(P＜0.01)(表1)。大蒜素、5-FU单独使用以及大蒜素联合5-FU对裸鼠体内ACC-M细胞移植瘤的生长均有明显的抑制作用，且大蒜素联合5-FU的抑制作用明显强于大蒜素或5-FU单独使用。

表1 各组移植瘤的体积变化及抑瘤率(±s)

表1 各组移植瘤的体积变化及抑瘤率(±s)

注：TV1各组平均瘤体积比较，P＞0.05；TV2各实验组与对照组比较，aP＜0.01，与大蒜素组比较，bP＜0.01，与5-FU组比较，cP＜0.05。

组别只数平均瘤体积(TV，mm3)抑瘤率(%) TV1TV2对照组大蒜素组5-FU组大蒜素联合5-FU组6666 47.64±7.42 56.59±10.41 58.10±6.47 53.67±7.99 925.87±142.26 551.57±105.37a316.89±31.00ab138.14±13.86abc0 40 66 85

2.2 HE染色观察裸鼠移植瘤移植瘤大体上呈结节性、膨胀性生长，质硬，外有薄膜包裹。HE染色观察裸鼠移植瘤(×200)示：对照组(图1)：可见大量癌细胞分布，且癌细胞生长旺盛，形态不规则，呈高度异型性，其核大深染，核质比例增大，核分裂相多见，镜下肿瘤组织实质多于间质；大蒜素组(图2)：可见肿瘤细胞减少；5-FU组(图3)：可见瘤组织大量坏死，癌细胞数减少，细胞核肿大，部分核固缩；大蒜素联合5-FU组(图4)：可见大量肿瘤组织呈现片状坏死，癌细胞增大且出现空泡变性，癌细胞数明显减少，纤维组织增生。

图1 对照组（×200）：肿瘤组织实质多于间质，癌细胞分布密集，且生长旺盛，呈高度异型性；图2大蒜素组（×200）：肿瘤细胞分布稀疏，可见部分坏死区域;图35-FU组（×200）：肿瘤组织大量坏死，细胞核肿大，部分核固缩；图4大蒜素联合5-FU组（×200）：可见大量肿瘤组织呈现片状坏死。癌细胞数明显减少，且出现空泡变性。

3 讨论

腺样囊性癌曾被称为“圆柱瘤”，是一种易发于口腔颌面部唾液腺组织中的恶性肿瘤，其在各个年龄阶段均有发生，目前人涎腺腺样囊性癌的治疗常规以手术治疗结合术前术后放化疗为主。5-FU是治疗ACC的常用化疗药物，但疗效往往不佳，主要系因其对放疗和化疗的敏感性均较低，疗效不显著，且手术切除后易复发、易沿神经扩散以及易发生远处转移等特点，致使腺样囊性癌患者出现较高的死亡率[1]。有关腺样囊性癌的发病和转移机制尚未完全阐明，加上其对于药物的敏感性较低，耐药性较强，因此利用动物模型研究其有效的防治方法显得尤为重要。侯亚丽等[9]将人复发性涎腺腺样囊性癌组织块进行裸鼠皮下移植，连续传代4次，成功构建了腺样囊性癌裸鼠移植瘤模型，其结果表明与原代瘤相比，传代瘤的潜伏期和体积倍增时间均较短。本研究将人腺样囊性癌ACC-M细胞接种于裸鼠右前斜背部皮下，成功构建了裸鼠皮下移植瘤模型，为进一步研究其药物防治提供基础。

大量研究表明大蒜在防癌抗癌中均具有良好的作用，而大蒜素由大蒜提取而来，其含有多种含硫化合物，具有较强的杀菌作用，在防癌抗癌中也发挥重要作用[3-6]。王海燕等[10]研究发现大蒜素对两种胃癌SGC-7901和MGC-803细胞均具有较强的杀伤作用，其可能通过直接杀伤胃癌细胞从而提高机体免疫来发挥抗癌作用。徐丽等[11]研究发现大蒜素可促进体外培养的NK细胞的增殖作用，抑制NK细胞的凋亡，并通过促进NK细胞分泌IFN-γ提高其对肿瘤的杀伤能力。马红兵等[12]研究发现大蒜素可抑制胰腺癌BXPC3细胞的生长，且具有放射增敏的作用。5-FU是一种广泛应用于头、颈、胸、胃肠和卵巢等部位恶性肿瘤的化疗药物，其作用机制为5-FU在细胞内转化产生的活性产物能影响DNA和蛋白质的合成，从而抑制肿瘤细胞的生长[13]。但5-FU的不良反应、对腺样囊性癌较低的敏感性以及腺样囊性癌对5-FU产生的耐药性等导致其疗效欠佳，因此5-FU与其他药物进行联合用药是目前研究的热点。研究表明黄癸素和5-FU联用对腺样囊性癌Acc-3细胞的抑制作用比单药使用更明显[14]。Zou等[15]研究发现大蒜素可通过ROS介导的线粒体途径增强肝癌细胞对5-FU的敏感性。王晓峰等[2]研究发现莱菔硫烷和5-FU联合使用可协同抑制人高转移唾液腺腺样囊性癌细胞的增殖，且可能与细胞核NF-kB p65的表达受抑制有关。吴发印等[7-8]研究发现大蒜素联合5-FU以及大蒜油联合5-FU均可有效抑制ACC-M细胞的生长，且其作用明显强于大蒜素、大蒜油或5-FU单独使用。之前的研究是在细胞水平上探讨大蒜素联合5-FU的作用效果，本研究通过建立ACC-M细胞Balb/c裸鼠皮下移植瘤模型，探讨大蒜素联合5-FU在动物水平上对腺样囊性癌的抑制作用。结果表明大蒜素、5-FU单独使用以及大蒜素联合5-FU对裸鼠体内ACC-M细胞移植瘤的生长均有明显的抑制作用，大蒜素的抑瘤率为40%，5-FU为66%，而大蒜素联合5-FU组高达85%，即大蒜素联合5-FU使用的抑制作用明显强于大蒜素或5-FU单独使用，可能是因为大蒜素增强了5-FU的药效的同时减轻了其副作用，与5-FU联合使用时对腺样囊性癌有协同抑制作用。本研究进一步证实了大蒜素和5-FU的抗癌作用，为拓展其临床应用奠定基础。

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Inhibitory effects of allicin combined with 5-FU on adenoid cystic carcinoma ACC-M in nude mice model.

CHE Chao1,WU Fa-yin1,LI Hua-lin1,ZHOU He-feng2.1.Department of Stomatology,Zhuhai Hospital,the Fifth Affiliated Hospital of Zunyi Medical University,Zhuhai 519100,Guangdong,CHINA;2.Department of Bioengineering,Zhuhai Campus,Zunyi Medical University,Zhuhai 519041,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo investigate the inhibitory effect of allicin combined with 5-fluorouracil(5-FU)on adenoid cystic carcinoma in nude mice models transplanted with ACC-M cells.MethodsThe nude mice xenograft models were established by subcutaneous injecting human adenoid cystic carcinoma cell line ACC-M into Balb/c nude mice.Twenty-four xenograft model rats were randomly divided into four groups(control group and three experimental groups of allicin group,5-FU group,and allicin combined with 5-FU group),with 6 rats in each group.The rates in the four groups received intraperitoneal injection of 0.01 mL/g medicine according to the weight of each nude mice,0.9% phosphate buffer saline(PBS),20 μg/mL allicin,20 μg/mL 5-FU,and 20 μg/mL allicin combined with 20 μg/mL 5-FU respectively,once per two days,for three times.The animals were executed after 1 week for measuring the xenograft tumor volume and observing the pathological changing by HE staining.ResultsThe xenograft tumor volume of three experimental groups had narrowed considerably.The tumor volume was significantly decreased in the 5-FU group compared with Allicin group,with statistically significant difference between allicin combined with 5-FU group and allicin group,5-FU group(P＜0.01).Under microscope,the cancer cells of the control group showed vigorous growth and high abnormal rate,while the cancer cells of the three experimental groups showed reduced quantity and increased intercellular substance to different extent,especially in allicin combined with 5-FU group.ConclusionAllicin and 5-FU can both effectively inhibit the growth of nude mice xenograft tumor of adenoid cystic carcinoma.And the inhibitory effects of allicin combined with 5-FU is more significant than either allicin or 5-FU used alone.

Allicin;5-fluorouracil;Adenoid cystic carcinoma(ACC);Nude mice;Xenograft tumor

R-332

A

1003—6350（2016）21—3441—03

2016-07-08)

贵州省科学技术基金项目[编号：黔科合J字LKZ(2010)07号]

吴发印。E-mail：wufy0515@163.com