调肝活血汤联合palomo手术对精索静脉曲张症患者精浆氧化应激干预的研究❋

古宇能，陈慰填，温志鹏△，曾杨玲，陈德宁

(1.深圳市中医院，广东深圳518033;2.广州中医药大学，广州510006)

调肝活血汤联合palomo手术对精索静脉曲张症患者精浆氧化应激干预的研究❋

古宇能1，陈慰填1，温志鹏1△，曾杨玲2，陈德宁1

(1.深圳市中医院，广东深圳518033;2.广州中医药大学，广州510006)

目的:观察经验方“调肝活血汤”联合palomo手术对精索静脉曲张症患者精浆氧化应激的影响。方法:选取99名精索静脉曲张症相关不育患者分成3组。试验组(G1)采用调肝活血汤联合palomo手术治疗，中药对照组(G2)单独采用调肝活血汤口服，手术对照组(G3)采用palomo手术共6个月，观察治疗前后精液质量和精浆ROS、NO、SOD、TAC的变化情况。结果:试验组精液质量和精浆TAC、SOD水平显著改善;ROS和NO有所降低，与对照组比较差异有统计学意义。结论:调肝活血汤联合palomo术能干预精浆中氧化应激反应，从而提高精液质量。

调肝活血汤;palomo手术;精索静脉曲张症;氧化应激

男性不育症是让众多家庭深感苦恼的疾病，也是男科学研究的重要领域［1］。临床常见类型为先天性生殖器官畸形、性功能障碍、精液质量下降等，其中弱精子症、少精子症及精子形态异常是最主要的原因。精索静脉曲张症(varicocele，VC)是与不育症相关的重要疾病，这在20世纪50年代就得到证实［2］。传统治疗VC多采用手术或者药物栓塞，效果有限且并发症多。笔者采用经验方“调肝活血汤”联合经典术式——Palomo术治疗VC相关不育症，并开展相关实验研究，现报道如下并对其机理作一探讨。

1 临床资料

1.1 病例选择

选取2012年11月至2014年9月在深圳市中医院男科门诊就诊的不育症患者99例，男性年龄最大46岁，最小27岁，平均年龄32岁;病程最短1年，最长4年，平均病程2年6个月。

1.2 诊断标准

1.2.1 西医诊断标准精索静脉曲张分度标准:按照曲张程度由轻到重划为4个等级［3］:①亚临床型:体检为阴性，超声在平静呼吸状态下探及精索静脉内无返流，做Valsalva动作时有返流，DR: 1.8～2.1 mm，TR:1～2 s;②精索静脉曲张Ⅰ级:体检触诊为阳性，做Valsalva动作时有返流，平静呼吸时DR:2.2～2.7 mm，TR:2～4 s;③精索静脉曲张Ⅱ级:体检触诊阳性，做Valsalva动作时有返流，DR:2.8～3.1 mm，TR:4～6 s;④VCⅢ级:触诊呈阳性，平静呼吸时DR≥3.1 mm，TR≥6 s，做Valsalva动作时返流明显。男性不育症标准:参考《WTO人类精液及精子—宫颈黏液相互作用实验检验手册》(第五版):育龄夫妻婚后同居1年以上，性生活正常而未采用任何避孕措施，由于男性方面原因造成女方不孕者;精子浓度＜15×106/ml为少精子症;前向运动精子比例＜32%为弱精子症。

1.2.2 中医诊断标准根据《中药新药临床研究指导原则》精索静脉曲张证型制定:肝气郁结证:症见精索静脉扩张，阴囊下垂，烦躁，情绪波动易怒，胸胁胀痛，腹部胀满，舌红苔黄，脉弦;气滞血瘀证:精索静脉扩张、盘曲成团，阵发性胀痛或刺痛，久站或劳累后加重，舌暗有瘀斑，脉弦细［4］。

1.2.3 纳入标准符合男性不育症诊断标准;符合肝气郁结证或气滞血瘀证者;CASA检测确定同时为少精子症和弱精子症者;单侧Ⅱ度以上精索静脉曲张或双侧I度以上精索静脉曲张患者。

1.2.4 排除标准对实验药物过敏者;年龄在20岁以下或55岁以上;具有泌尿生殖系统炎症、先天生殖器官畸型、勃起功能障碍或早泄、染色体异常者;具有严重的慢性疾病如肝硬化、肺结核、恶性肿瘤、心肌梗死者;患者配合度差，可能无法遵医嘱完成研究全过程者;具有不良嗜好如酗酒、熬夜，或服用对精子有明确影响的药品者;长期工作在高辐射、高温环境者。

1.2.5 脱落标准用药过程中发生明显身体不适或严重不良反应中出现并发症;或因出现新的疾病不合适继续接受试验者。

2 方法

2.1 实验设计

采用随机区组设计的设计方案。根据区组随机化原则，将接收研究的患者编为33个区组，将每一区组的3位患者各自分配到试验组(G1)和中药对照组(G2)、手术对照组(G3)，这样可以避免研究时间较长导致的非同期对照偏倚及组间人数差异过大。

2.2 治疗方法

2.2.1 G1组(试验组)采用经皮小切口腹膜外超选择性精索内静脉高位结扎术(高位血管集束结扎法)。手术方式:定位在髂前上嵴内侧约3 cm，平行于腹股沟韧带，取内环上方3 cm开口，长约2～3 cm。先切开皮肤，逐步分离至后腹膜腔，然后打开精索筋膜，寻找固定精索内静脉大约3～4 cm，切断后两断端双重结扎。探查阴囊，寻找剩余充盈的精索内静脉分支并逐一缝扎细小的静脉分支。最后用4号丝线皮内美容缝合皮肤切口，不拆线。术后3 d开始口服经验方“调肝活血汤”:柴胡10 g，白芍20 g，桔梗10 g，枳壳20 g，牛膝10 g，橘核10 g，桃仁10 g，红花5 g，当归10 g，生地10 g，川芎5 g，水蛭5 g。中药饮片由深圳和顺堂药业有限公司提供，深圳市中医院制剂室按照常规煎药方法制作)，治疗时间为6个月。治疗结束后连续随访3个月。

2.2.2 G2组(中药对照组)口服“调肝活血汤”每日1剂，分2次服，治疗时间为6个月，治疗结束后连续随访3个月。

2.2.3 G3组(手术对照组)单独采用Palomo术，手术后按常规方式抗菌消炎，给予一定营养支持，不适用任何可能对生育有影响的药物及理疗方式，术口愈合后出院，1个月内不做剧烈运动，随访3个月。

2.3 观察指标

治疗前后分别检测精液质量分析(CASA)，记录精液常规指标(精子密度、前向精子比例、精子活动率、畸形率);测定活性氧(reactive oxy-gen species，ROS)、一氧化氮(nitric oxide，NO)、超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD)、总抗氧化能力(total antioxidant capacity，TAC)水平，记录治疗前后和治疗过程中的临床症状，进行血、尿、粪常规化验和肝、肾功能检查。

2.4 检验方法

2.4.1 精液收集患者禁欲2～7 d，自慰或女方帮助手淫取得精液置于专用容器中，再保存于37℃温箱中，30 min后上机检查。

2.4.2 精液常规参数测定采用北京伟力彩色精子质量检测系统(BJWL 9000)，分析精子密度、精液量、精子活动率、前向精子比例，标准参考世界卫生组织推荐的指南。

2.4.3 精子畸形指数采用Diff-Quik法染色检测。

2.4.4 精浆ROS测定精液ROS水平用化学发光法检测。400 μL完全液化后的精液加入一次性照度计容器内，取4 μL鲁米诺储存液，同时加入8 μL辣根过氧化物酶(12.4 U的Ⅵ型辣根过氧化物酶，310 U/mg)。使用Berthold照度计检测化学发光信号约5 min直至达到稳定。为平衡精子密度对各组ROS水平带来的混杂作用，按照下式计算调整各组ROS水平:平衡精子密度后的ROS水平=相对化学发光强度(RLU/s)×20×106/精子密度(精子数/ml)×0.4 ml，计算后的ROS单位为RLU/s每20×106精子。

2.4.5 精浆TAC的测定精浆中总抗氧化能力可用增强化学发光法来测定。冷冻的精浆样品在室温下解冻后立即进行TAC测量。精浆用去离子水(dH2O)1∶20稀释后0.20 um滤器过滤。信号试剂的配制:30 ul H2O2(8.8 mol/L)，10 ul对-碘酚储备液(41.72 umol/L)，110 ul鲁米诺储备液(3.1 mmol/L)，10 ml Tris缓冲液(0.1 mol/L pH8.0)。HRP工作液的配制是将HRP储备液按1∶1用dH2O稀释产生3×107cpm的化学发光值。

2.4.6 SOD测定采用黄嘌呤氧化酶法(羟胺法)测定精浆中SOD活力。冷冻的精浆在室温下解冻至4℃作为待测样品。WST-1可与黄嘌呤氧化酶催化产生的超氧化物阴离子反应产生水溶性的甲染料，该反应步骤可以被SOD所抑制。通过对WST-1产物的比色分析即可计算SOD酶活力。

2.4.7 NO测定采用比色法，收集解冻的精浆，酶标仪550 nm处测吸光度值，每个样品3个复孔取均值。根据标准孔作出亚硝酸钾浓度-吸光度值标准曲线，依据样品孔吸光度值在标准曲线上求得各样孔浓度，记作精浆中NO水平。以上检验由深圳市中医院临床细胞分子生物学实验室测定。

2.5 统计学方法

采用SPSS 10.0 for windows计算软件先进行方差齐性分析，等级资料采用Ridit检验，计量资料采用随机区组设计资料的方差分析，并进一步作两两比较，组内前后采用配对检验，脱落病例采用末次观测结转法填补缺失数据，P≤0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 各组精液质量和精子畸形率比较

表1显示，G1组、G2组、G3组治疗后精子畸形率、精子密度、前向精子运动比例、精子活动率均优于治疗前，差异有统计学意义(P＜0.05);治疗后G1组与G2、G3组比较差异有统计学意义，G1组为佳(P＜0.05)。

表1 各组治疗前后精液质量、精子畸形率比较(±s)

表1 各组治疗前后精液质量、精子畸形率比较(±s)

注:与治疗前比较:△P＜0.05;与G2组比较:▲P＜0.05;与G3组比较:●P＜0.05

组别例数时间精子密度(×106/ml)前向运动精子比例(%)精子活动率(%)精子畸形率(%) G1组33治疗前10.19±2.24 13.08±2.40 21.62±3.58 74.71±9.04治疗后54.13±4.76△▲●42.53±1.18△▲●51.34±6.07△▲●32.25±6.3△▲●G2组33治疗前10.26±1.90 14.37±2.71 20.97±3.58 74.46±9.24治疗后37.44±3.06△27.94±3.58△36.49±1.87△54.09±6.14△G3组33治疗前10.26±1.46 13.97±2.70 20.54±4.53 73.61±6.83治疗后32.58±2.17△28.42±3.06△37.83±4.62△50.18±5.03△

3.2 各组ROS、NO、SOD、TAC水平

表2显示，G1组、G2组、G3组治疗后与治疗前比较精浆ROS、NO均有所降低，SOD、TAC水平有所提高，差异有统计学意义(P＜0.05);治疗后G1组与G2、G3组比较差异有统计学意义，G1组为佳(P＜0.05)。

表2 各组精浆ROS、NO、SOD、TAC水平比较(±s)

表2 各组精浆ROS、NO、SOD、TAC水平比较(±s)

注:与治疗前比较:△P＜0.05;与G2组比较:▲P＜0.05;与G3组比较:●P＜0.05

组别例数时间ROS(RLu/S)NO(μmol/L)SOD(U/ml)TAC(U/L) G1组33治疗前38.15±1.02 78.95±3.01 8.36±4.02 24.65±0.25治疗后25.23±2.21△▲●45.21±4.23△▲●12.28±0.38△▲●36.69±2.47△▲●G2组33治疗前36.22±1.21 75.18±3.25 9.89±3.69 24.18±1.32治疗后30.25±2.82△58.36±4.51△10.54±4.55△30.28±0.41△G3组33治疗前38.63±2.36 74.85±3.11 8.19±4.26 24.54±0.99治疗后29.65±2.53△49.22±4.01△10.48±4.87△31.56±0.45△

3.3 不良事件和不良反应

3组肝、肾功能均未见异常;血、尿、粪化验正常;G3组有1例患者术后3 d出现术口红肿，给予抗菌消炎及远红外灯治疗后恢复正常。

3.4 随访

试验结束后电话随访，未发现与药物有关的严重不良反应。

3.5 脱落病例

所有患者都遵从要求完成试验，未见脱落病例。

4 讨论

中医称精索静脉曲张症为“筋瘤”“筋疝”或“偏坠”，是指精索蔓状静脉丛发生扩张、伸长及迂曲，原因可能是血管瓣膜功能不健全、静脉回流受阻、血液返流、瘀滞等［5］。精索静脉曲张为泌尿系统中的常见疾病，好发于左侧，青壮年多见，且对睾丸的损害呈双侧性［6］。VC具有家族遗传倾向性，发病率可随年龄的增长而升高［7］。在男性不育症的诸多因素中精索静脉曲张是一种常见原因，特别是临床III级曲张，常引起少精子、弱精子症甚至睾丸萎缩。病理研究发现，精索静脉曲张会导致睾丸中氧自由基浓度和一氧化氮(NO)浓度升高，肾脏及肾上腺毒素滞留;睾丸瘀血、缺氧引起睾丸微循环障碍［8］;干扰血清生殖激素的分泌，造成睾酮下降、泌乳素升高，从而导致精子生成与成熟障碍［9］。

氧化应激(Oxidativestress，OS)是指当氧化物含量超过抗氧化物含量，从而形成的过氧化产物增多引起的一系列病理现象。最新研究发现，精浆氧化应激水平与VC严重程度存在正相关［10］。精子在睾丸精曲小管生发与分化过程中需要保持氧化与抗氧化生理性平衡，而VC造成精浆氧化应激并打破了这种平衡。适当的氧化反应可清除睾丸中衰老、结构缺陷的精子细胞，对种族繁衍具有积极意义。但氧化应激则导致精子活力减弱、顶体反应受损、精子DNA损伤等，从而损害了男性的生殖能力。一氧化氮代谢紊乱和活性氧含量升高是2种常见的氧化应激病理机制。人类精浆存在一整套抗氧化防御机制，使精子免于氧化攻击，保护精子的正常代谢，其中酶类抗氧化物如超氧化物歧化酶是重要的武器，如果抗氧化因子减少会促使氧化应激的发生。所以本课题引入ROS、NO、SOD作为重点观测对象，并通过检测精浆中总抗氧化能力来评价试验效果。

精索静脉高位结扎术是应用于治疗VC的常用手段，Palomo术为改良型术式，疗效得到一致肯定。但手术仍然具有一定风险，包括感染、出血过多、误伤输精管等，术后需要较长恢复时间，容易并发睾丸鞘膜积液、急性附睾炎、自身免疫性损伤等;加上患者对手术的顾虑使该方法应用受到限制［11］。探索中西医结合方式，取长补短，既可以增加疗效，又可以减少并发症，或许是一种行之有效的途径。

本试验结果显示，无论是单独采用调肝活血汤、palomo手术治疗还是调肝活血汤联合palomo手术治疗，患者精子密度都有所增加，提高了前向精子比例和精子活动率，精子畸形率有所减少，显示3组治疗方法都能改善患者的精液质量。经过统计发现，调肝活血汤联合palomo手术组疗效优于对照组;各组治疗后精浆ROS、NO水平下降，说明该治疗方案有效降低了睾丸中的氧化应激;SOD、TAC的增加，提示治疗后患者精浆的抗氧化能力有所增强，生精上皮功能得到保护。同样试验组疗效优于对照组，显示了中西医结合治疗具有一定的优势，比单纯中药治疗或手术治疗更能减轻氧化应激损伤。其原理可能有以下几方面:一是缓解精索静脉内血液瘀阻现象，降低睾丸温度。本试验用药为清代名医王清任的经典名方血府逐瘀汤为基本方加减而成，具有活血化瘀不伤血、疏肝解郁而不耗气的特点，使得“肝脉条达，气血平正”。加上手术改变了血流动力学，消除了返流，为精子生长与分化提供了较好的环境。二是应用中药可加快术后精索静脉侧枝循环的建立，促进炎性物质的吸收与代谢，减轻了术后阴囊水肿以及自身免疫损伤等并发症。三是应用活血化瘀中药能改变血液高凝状态，改善睾丸和附睾的微循环，防止性腺分泌管道阻塞，这是单独手术所不能做到的。实验证明，调肝活血汤联合palomo手术法还可以缓解VC患者阴囊胀痛、潮湿等症状以及由此产生的焦虑、抑郁，是一种值得推广的方法。而不足之处为研究时间有限，样本量还不够大，以后可以增加样本含量，从多中心多靶点进一步深入研究分析。

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［2］张元芳，孙颖浩，王忠.实用泌尿外科和男科学［M］.北京:科学出版社，2013:153.

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［11］吴阶平.吴阶平泌尿外科学［M］.济南:山东科学技术出版社，2006:1945.

Observation of TiaoGanHuoXue Decoction Combined with Palomo Operation on the Oxidativestress in the Patients with Varicocele

GU Yu-neng1，CHEN Wei-tian1，WEN Zhi-Peng1△，ZENG Yang-lin2CHEN De-ning1
(1.Shenzhen Hospital of Traditional Chinese Medicine，Shenzhen 518033，Guangdong，China; 2.Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510006，Guangdong，China)

objective:To observe the efficacy of TiaoGanHuoXue decoction combined with Palomo operation on the oxidativestress in the patients with Varicocele Methods:Nighty-night patients with Infertility caused by varicocele were randomly divided into three groups.The G1treatment group treated with TiaoGanHuoXue decoction combined with Palomo operation.The G2control group treated with TiaoGanHuoXue decoction and the G3control group treated with Palomo operation.The therapeutic efficacy and the content of ROS、NO、SOD、TAC were evaluated after six months.Results:The treatment group showed a better effect than two control groups in improving sperm quality.The content of TAC and SOD was increased and the content of ROS and NO was decreased.Conclusion:TiaoGanHuoXue decoction combined with Palomo operation could improve the sperm quality for the patients with Oligoasthenozoospermia by improving oxidativestress.

TiaoGanHuoXue decoction;Palomo operation;Varicocele;Oxidativestress

R285.5

:B

:1006-3250(2016)05-0651-04

2015-10-06

2012年深圳市科技计划项目(201202156)-精索静脉高位结扎术联合调肝活血汤对VC患者精液质量的影响和精浆氧化应激干预的研究

古宇能(1979-)，男，广东梅州人，副主任医师，医学硕士，从事泌尿男科的临床与研究。

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:温志鹏，Tel:13713940819。