肺炎链球菌蛋白质疫苗研究进展

骆诗露，黄健，韩道宾，朱杰华，陈泽慧，闵迅

(遵义医学院，贵州遵义563003)



肺炎链球菌蛋白质疫苗研究进展

骆诗露，黄健，韩道宾，朱杰华，陈泽慧，闵迅

(遵义医学院，贵州遵义563003)

摘要：随着肺炎链球菌(SP)耐药菌株的不断出现使得疫苗研发备受关注，但目前使用的荚膜多糖及其结合疫苗有很大局限性。因此，针对SP主要毒力因子的蛋白质疫苗迅速发展,其中SP单一蛋白质疫苗包括溶血素、表面蛋白A、表面黏附素A、三组氨酸蛋白D、黏附毒力因子A，蛋白质联合疫苗包括多价重组蛋白质联合疫苗、多价蛋白质融合疫苗，已取得一定实验和临床效果，有望替代多糖疫苗。

关键词：肺炎链球菌；重组蛋白；联合疫苗；融合疫苗

肺炎链球菌(SP)是一种重要的人类致病菌，主要引起细菌性肺炎、中耳炎、脑膜炎等疾病，2岁以下婴幼儿和60岁以上老年人是其最主要的易感人群。随着耐药菌株的不断出现，通过接种疫苗已成为预防SP感染行之有效的手段。目前，市售的SP疫苗均基于其血清特异性荚膜多糖(CPS)设计，主要有多糖疫苗(PPV)、多糖结合疫苗(PCV)。PPV免疫原性较弱，对SP主要易感人群的保护性较差，对成人SP肺炎以及支气管炎的作用很弱甚至没有作用；PCV虽能有效保护主要易感人群，但存在覆盖面窄(仅为欧美国家的常见血清型)、制备成本较高、使用过程中存在荚膜血清型转换等缺点，严重限制了其在发展中国家的使用。因此，蛋白质疫苗已成为近十年SP疫苗的研发主流。本文就SP单一蛋白质疫苗及其联合、融合蛋白疫苗的研究进展综述如下。

1SP单一蛋白质疫苗

1.1SP溶血素(Ply)Ply是一种胆固醇依赖的造孔毒素，其具有直接的细胞毒性作用，能与宿主上皮细胞表面的胆固醇结合并插入到脂质双分子层中以形成寡聚孔，能引起细胞溶解并促进细菌扩散；此外，Ply还能通过与C1q、Fc段及CRP结合以激活补体经典途径，也能诱导中性粒细胞产生炎性细胞因子IL-1β，从而参与宿主的炎性反应。因Ply在低浓度作用时的促炎效应可导致严重的肺损伤及细胞凋亡，所以当前运用的疫苗主要是经过化学减毒或无毒化处理后的衍生物，如第433位苯丙氨酸替换色氨酸的PdB及第146位丙氨酸缺失的ΔA146Ply。Knippenberg等[1]以PdB主动免疫小鼠后，可以阻断Ply介导的肺纤维化效应。在构建的小鼠鼻黏膜免疫模型中，ΔA146Ply能诱导小鼠产生有效的细胞免疫及体液免疫应答，可抵抗不同型别SP引起的致死性感染[2]。此外，PlyD1无毒衍生物已经进入Ⅰ期安全性及人体免疫原性试验，证实成人经免疫后能产生大量的抗PlyD1的保护性抗体[3]。

1.2SP表面蛋白A(PspA)PspA是SP表面的胆碱结合蛋白，也是一种重要毒力因子。目前，已在其N端和脯氨酸富集区发现有B细胞抗原表位的存在。在小鼠系统性感染模型中，PspA可干扰C3b在SP表面沉积，阻止补体介导的调理吞噬作用；并且在小鼠黏膜感染模型中，能够保护SP免遭宿主乳铁蛋白的攻击[4～6]。此外，Roche等[7]构建的Balb/c小鼠败血症模型中，经皮下或腹腔途径免疫全长的PspA，可以显著提高小鼠的生存时间及生存率。Arulanandam等[8]构建的小鼠鼻咽定植模型证实，经鼻腔滴注全长的PsaA与IL-12可减少75%的鼻咽部SP定植量。在小鼠中耳炎模型中，PspA抗体同样能够提供有效的保护。

1.3SP表面黏附素A(PsaA)PsaA是一种分子量为37 kD的多功能脂蛋白，其在不同的血清型SP中具有较高的保守性，主要参与SP对Mn2+、Zn2+的转运及对宿主上皮细胞的黏附效应。有研究证实，与野生型TIGR4菌株相比，PsaA缺陷菌株能显著降低其对鼻咽癌细胞的黏附能力及其对CBA/N小鼠的系统性感染能力[9]。PsaA与CT佐剂联合经鼻咽部免疫小鼠后，可诱导其产生高滴度黏膜抗体IgA；而口服微粒体包裹的PsaA蛋白，血清中可产生高滴度的IgG和IgA抗体，从而抵抗不同血清型SP在肺部定植及败血症的形成。Oliveira等[10]将PsaA与乳酸杆菌活菌载体共同经鼻腔免疫C57BL/6小鼠后，能够同时诱导PsaA特异性的系统免疫抗体IgG和黏膜免疫抗体IgA的产生，从而抑制SP在鼻咽部定植。

1.4SP三组氨酸蛋白D(PhtD)PhtD是Pht家族中最保守的蛋白，能够介导SP黏附宿主呼吸道上皮细胞及参与调节Zn2+的动态平衡；帮助逃避补体的免疫沉积，激发小鼠体液免疫和细胞免疫应答[11，12]。在OF1雌性小鼠鼻咽部致死性攻击模型中，经肌肉接种PhtD蛋白后，能对不同血清型SP的致死性攻击产生很好的保护效果，且健康人体内获得的抗PhtD血清也能给小鼠败血症模型中提供较高的被动保护效果[13]。此外，恒河猴经肌肉接种PhtD蛋白后，能显著提高其对19F型SP所致肺炎的抵抗力[14]。针对PhtD重组蛋白疫苗的Ⅰ期临床试验证实，健康成人免疫接种该蛋白后，能产生很好的体液免疫效果，且未产生明显的不良反应[15]。与传统的铝佐剂相比，PhtD与新型佐剂AS02V联合使用后，能显著促进PhtD触发的体内CD4+T细胞及记忆性B细胞的产生，从而提升对老年人的免疫保护效果[16]。因此，PhtD成为当前单个疫苗或联合疫苗的首选。

1.5SP黏附毒力因子A(PavA)PavA为SP细胞壁外层的一种纤维连接蛋白结合蛋白，在细菌早期黏附及侵袭过程中发挥关键作用。与D39ΔPavA缺陷菌株相比，野生型菌株能逃避人树突状细胞的吞噬及机体的固有免疫应答[17]。在构建的脑膜炎模型中，D39ΔPavA 菌株感染小鼠的毒力明显下降，且黏附A549、Hep-2细胞、人脑微血管内皮细胞和人脐静脉内皮细胞的能力也受到了明显的抑制[18]。

2SP蛋白质联合疫苗

目前，尚未见单一SP蛋白质疫苗保护作用强于PPV23的报道。因此，研究者将不同毒力因子进行组合以制备SP蛋白质联合疫苗，且蛋白间的共同作用可能起互补效应。文献报道，重组PhtD及PspA联合疫苗即将启动Ⅱ期临床。

2.1多价重组蛋白质联合疫苗Briles等[19]将混合后的PspA、PsaA经鼻腔免疫小鼠,比二者单独免疫更能有效阻止SP在鼻咽部的定植。在19F所致的肺炎模型中，证实PspA和Ply联合免疫能有效抵抗菌血症甚至是败血症[20]。Ogunniyi等[21]研究发现，与单个蛋白免疫相比，将PdB、PspA、PspC等两两组合，能显著提高不同血清型SP侵袭性感染小鼠的中位生存率，且3种蛋白联合主动免疫小鼠能使保护效果达到最佳。在近期的临床对照研究中，SP胆碱结合蛋白A (PcpA)+ PhtD+ PlyD1三者联合疫苗主动免疫不同年龄阶段人群，显示出较高的安全性及免疫原性[22]。但是，也有3种蛋白抗原联合的保护作用不及两两联合者的报道，可能为联合免疫存在拮抗效应所致。因此，仍需继续临床前尝试，力争找出最优化的多价重组蛋白质联合疫苗。

2.2多价蛋白质融合疫苗融合蛋白是一种将表达不同蛋白的功能活性域联合协同作用使融合蛋白性能被优化,甚至产生新的生物学活性的新技术。Lu等[23]以PsaA-PspA融合蛋白免疫小鼠后，可以诱导其产生大量抗PsaA、PspA抗体，该抗体可以与表达异源PspA的不同血清型SP结合；在鼻咽部攻击模型中，与无菌磷酸盐缓冲液(PBS)相比，经融合蛋白免疫的小鼠可显著减少其血及肺部定植的细菌量。融合蛋白PsaA-SP溶血素无毒衍生物(PdT)与SP细胞壁肽聚糖混合后经鼻腔或皮下免疫小鼠，能引起血清中高滴度抗体和IL-17A的产生，并能在高毒力3型SP攻击模型中提供保护[24]。

在Liu等[25]研究中首次证实了ΔA146Ply具有黏膜佐剂的功能， SP热休克蛋白(DnaJ)-ΔA146Ply融合蛋白表达后通过黏膜途径能诱导C57BL/6小鼠产生较高水平的特异性抗体IgG和sIgA，能有效帮助小鼠抵抗SP在鼻咽部、肺部定植及致死性感染。而SP胆碱结合蛋白A(CbpA)活性肽与 Ply类毒素L460D融合后，其保护效力更为强大，其诱导产生的抗体除了能够抵抗SP引起的各种侵袭性疾病(IPD)外，还具有潜在的抵抗其他引起脑膜疾病的病原菌的能力[26]。新近研究显示，ΔA146Ply基因与 PsaA融合后，能促进儿童黏膜免疫系统中Th1/Th17细胞增殖，有助于抗SP的CD4+T细胞免疫活性的发挥。融合蛋白是一种安全有效的新型疫苗，但在融合蛋白的构建过程中难免会影响或破坏蛋白质原有的结构，从而影响其活性的发挥。因此，在进行蛋白融合时应选择合理的方式，使两种蛋白质的效应均得到最大程度发挥。

目前，PPV和PCV疫苗的保护效果仅覆盖部分SP血清型别，且存在血清型替换等诸多问题。因此，研发新型蛋白质疫苗迫在眉睫。当前，研究者多选择与SP致病过程密切相关的的多价蛋白质联合或者蛋白融合疫苗为研究对象，以观察其对实验动物是否具有显著的保护效应。迄今为止，尚无FDA批准的SP蛋白质疫苗上市，但随着相关研究的不断深入，多价SP蛋白质疫苗必将造福于人类。

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(收稿日期：2015-11-23)

中图分类号：R378.1

文献标志码：A

文章编号：1002-266X(2016)10-0102-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.10.046

通信作者：闵迅(E-mail: 2815400619@.com)

基金项目：国家自然科学基金资助项目(81460317)；贵州省联合基金项目(黔科合LH字[2014]7553号)。