经颅磁刺激对帕金森病小鼠侧脑室下区神经干细胞增殖的影响

曹华

(大连医科大学附属第一医院,辽宁大连116011)



经颅磁刺激对帕金森病小鼠侧脑室下区神经干细胞增殖的影响

曹华

(大连医科大学附属第一医院,辽宁大连116011)

目的观察经颅磁刺激对帕金森病小鼠侧脑室下区神经干细胞增殖的影响。方法取8～12周清洁级健康成年雄性C57BL/6J小鼠54只，随机分为对照组、模型组和观察组，各18只。模型组和观察组皮下注射MPTP建立急性帕金森病小鼠模型。观察组在末次注射MPTP 24 h后对小鼠进行重复经颅磁刺激干预，频率为1 Hz，每次时间为25 s，5次/d。模型组和对照组不予处理。刺激第1、3、7天后各组各取6只处死取脑组织，用免疫组化法染色，光镜下计数侧脑室下区巢蛋白阳性细胞数，以此观察神经干细胞增殖情况。结果 对照组刺激第1、3、7天时侧脑室下区巢蛋白阳性表达细胞数差异无统计学意义。模型组小鼠侧脑室下区巢蛋白阳性表达细胞数随着刺激时间的延长而增加(P均<0.05)，且刺激第3、7天时模型组小鼠侧脑室下区巢蛋白阳性表达细胞数明显高于对照组同时点(P均<0.05)。观察组小鼠侧脑室下区巢蛋白阳性表达细胞数随着刺激时间的延长而增加(P均<0.05)，且刺激第1、3、7天时观察组小鼠侧脑室下区巢蛋白阳性表达细胞数明显高于模型组同时点(P均<0.05)。结论经颅磁刺激可以促进帕金森病小鼠侧脑室下区神经干细胞增殖。

经颅磁刺激；帕金森病；神经干细胞；小鼠

帕金森病又称震颤麻痹，由脑内黑质纹状体通路多巴胺缺乏导致，临床表现以震颤、肌强直、运动减少和姿势异常为主要特征[1]。近年来研究发现，帕金森病患者不仅存在运动障碍，而且同时伴发诸多非运动症状，如情绪与认知障碍等，给患者的生活质量带来严重影响[2]。无论是药物还是外科手术都只能改善帕金森病部分症状，无法有效防治神经系统退行性变性，长期疗效均不够理想[3,4]。神经干细胞的增殖有助于神经系统损伤的修复[5]。巢蛋白特异性的表达在神经上皮干细胞上。巢蛋白仅在胚胎发育早期的神经上皮细胞上表达，出生后表达就停止，为神经干细胞的特征性标志物，目前已被广泛应用于神经干细胞的检测。神经干细胞通常情况下处于静息状态，但在疾病或损伤等病理状态下，会迅速增殖，自发性地替代受损的神经组织，帮助神经功能恢复。因此,寻求促进神经干细胞增殖的方法成为目前帕金森病治疗研究的新热点[6]。经颅磁刺激(TMS)是用低强度电磁场刺激大脑，改变患者大脑异常的脑电波，促使大脑分泌一系列对抗焦虑、抑郁、失眠等的神经递质和激素，以此实现对这些疾病的治疗。实验证明，低频电磁场可有效促进体内和体外的神经细胞增殖[6]。此外研究亦发现，TMS可促进大鼠海马神经干细胞的增殖，帮助受损神经功能快速恢复[7]。2015年4～7月，我们观察了TMS对帕金森病模型小鼠侧脑室下区巢蛋白阳性表达的神经干细胞数目的影响。现报告如下。

1　资料与方法

1.1分组造模与干预处理8～12周清洁级健康成年雄性C57BL/6J小鼠54只(购自山东大学动物中心)，体质量18～20 g。安静环境饲养，室温20～22 ℃，自由取食饮水，人工昼夜节律(光照、黑暗各半)。随机分为对照组、模型组、观察组，各18只。模型组、观察组小鼠皮下注射4次神经毒素1-甲基-4-苯基-1、2、3、6-四氢吡啶(MPTP)15 mg/kg制备帕金森病动物模型。小鼠注射MPTP后出现震颤、竖尾、后肢张开、步态不稳等行为障碍，并伴随肢体僵硬、运动减少、反应迟缓为帕金森病模型制备成功。观察组在末次注射MPTP 24 h后对小鼠进行重复经颅磁刺激干预，频率为1 Hz，每次时间为25 s，5次/d。模型组和对照组不予处理。

1.2侧脑室下区巢蛋白表达检测采用免疫组化法。刺激第1、3、7天后各组各取6只小鼠用4%的多聚甲醛灌注固定脑组织，断头去除小脑保留大脑，置于4%多聚甲醛固定72 h。将固定好的脑组织制作连续冠状石蜡切片，片厚7.5 μm，行免疫组化染色。操作按试剂盒说明书进行。一抗工作浓度1∶100，显微镜下于200倍视野计数脑片上同一侧侧脑室巢蛋白阳性表达细胞数，取平均值。细胞质内出现棕色颗粒为巢蛋白表达阳性。

2　结果

各组小鼠刺激第1、3、7天侧脑室下区巢蛋白阳性表达细胞数见表1。由表1可见，对照组刺激第1、3、7天时侧脑室下区巢蛋白阳性表达细胞数差异无统计学意义。模型组小鼠侧脑室下区巢蛋白阳性表达细胞数随着刺激时间的延长而增加(P均<0.05)，且刺激第3、7天时模型组小鼠侧脑室下区巢蛋白阳性表达细胞数明显高于对照组同时点(P均<0.05)。观察组小鼠侧脑室下区巢蛋白阳性表达细胞数随着刺激时间的延长而增加(P均<0.05)，且刺激第1、3、7天时观察组小鼠侧脑室下区巢蛋白阳性表达细胞数明显高于模型组同时点(P均<0.05)。

表1　各组小鼠刺激第1、3、7天时侧脑室下区巢蛋白阳性表达细胞数比较±s)

注：与同组刺激1 d相比，aP<0.05；与对照组同时点相比，bP<0.05；与模型组同时点相比，cP<0.05。

3　讨论

帕金森病是中老年较常见的中枢神经系统变性疾病，50岁以后发病率逐渐升高，男性多于女性[8]。其病因至今尚未明确，但普遍认为其发生和发展是衰老、环境污染与遗传易感性共同作用的结果[9]。黑质细胞变性达60%，黑质细胞内多巴胺水平降低至原来80%即可出现帕金森病临床表现[10]。由神经毒素MPTP诱导的动物模型在神经化学、行为学及组织病理学方面的表现与临床帕金森病患者非常接近。本研究应用C57BL/6J小鼠制备帕金森病模型，结果表明小鼠每次注射MPTP后短时间内即出现震颤、竖尾、后肢张开、步态不稳等行为障碍，随着给药次数的增加，肢体僵硬、运动减少、反应迟缓症状愈加明显，表明MPTP致小鼠帕金森病模型制备成功。

TMS是一种无痛、无创的绿色治疗方法，治疗原理是用低强度的电磁场直接刺激主管心理及情绪活动的大脑、下丘脑、边缘系统及网状结构系统，促使其分泌释放能够调节个体情绪与认知的各种神经介质如5-羟色胺、内啡肽、褪黑素、γ-氨基丁酸[11]。TMS还可以改变皮层神经细胞的膜电位，使之产生感应电流，影响脑内代谢和神经电活动；此外，磁信号可以无衰减地透过颅骨刺激大脑神经，也可以刺激外周神经及其支配的肌肉。目前TMS已被应用于神经内科(癫痫病)、神经心理科(抑郁症、精分症)、康复科、儿科(脑瘫)。

神经干细胞是指存在于神经组织中，具有分化为神经元、星形胶质细胞以及少突胶质细胞的能力，且能自我更新的一类细胞。哺乳动物中枢神经系统内多个部位均存在神经干细胞，其中侧脑室壁的脑室下区作为重要的神经发生区，其神经干细胞可保持终生[12]。因此，本研究在取材时将位置定于侧脑室下区。

关于帕金森病模型动物神经干细胞增殖的研究迄今为止开展较少。研究发现，帕金森病模型大鼠自身神经干细胞被激活，后者参与了帕金森病的神经元修复过程，但正常情况下激活的细胞数量较少，因此其发挥的作用非常有限[13]。TMS共有3种主要的刺激模式：单脉冲TMS(sTMS)、双脉冲TMS(pTMS)和重复性TMS(rTMS)。每种刺激模式分别与不同的生理基础及脑内机制相关。rTMS用于治疗可以通过改变它的刺激频率达到兴奋或抑制局部大脑皮质功能的目的。高频(>1 Hz)rTMS主要起兴奋作用，低频(≤1 Hz)则起抑制作用[14]。高频率、高强度rTMS可产生兴奋性突触后电位，导致刺激部位神经异常兴奋，低频刺激的作用则相反。rTMS通过双向调节大脑兴奋与抑制功能之间的平衡来治疗疾病。

从电生理学角度来看，中枢神经系统细胞被分为兴奋性细胞和非兴奋性细胞两大类。兴奋性细胞即神经细胞，具有活跃的电生理活动特性；非兴奋性细胞如胶质细胞，其电生理特性相对较为稳定。在磁刺激的作用下，rTMS可引起细胞膜的局部去极化兴奋，诱发组织内产生感应电流，触发一系列磷酸化生物信号放大反应，刺激兴奋性细胞，影响相应脑神经细胞电活动和局部功能，进而影响中枢神经系统。动物实验研究表明，磁刺激治疗后大鼠损伤的脊髓组织巢蛋白阳性细胞数量增多，提示磁刺激可有效促进损伤脊髓的再生，修复神经功能[15]。此外研究发现，rTMS可引起神经营养因子基因表达的变化，从而发挥保护神经的作用，同时神经营养因子的增加可促进神经干细胞的增殖。但在使用过程中对于不同患者的大脑功能状况，需用不同的强度、频率、刺激部位、线圈方向，才能取得良好的治疗效果。本研究结果显示，模型组小鼠侧脑室下区巢蛋白阳性表达细胞数随着刺激时间的延长而增加，且刺激第3、7天时模型组小鼠侧脑室下区巢蛋白阳性表达细胞数明显高于对照组同时点。观察组小鼠侧脑室下区巢蛋白阳性表达细胞数随着刺激时间的延长而增加，且刺激第1、3、7 天时观察组小鼠侧脑室下区巢蛋白阳性表达细胞数明显高于模型组同时点。提示急性帕金森病小鼠本身可刺激神经干细胞增殖；rTMS可以更有效的促进神经干细胞增殖。

综上所述，通过皮下注射MPTP可成功制备帕金森病小鼠模型。经颅重复磁刺激后帕金森病小鼠神经干细胞增殖明显增多，提示经颅磁刺激在改善神经功能损伤方面具有重要应用价值。

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10.3969/j.issn.1002-266X.2016.26.010

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1002-266X(2016)26-0035-03

2016-04-12)