强直性脊柱炎患者髋关节滑膜组织中骨硬化蛋白、β-链蛋白表达观察

祁伟仲，李奇，林荔军，王宇召，陆遥

(南方医科大学珠江医院，广州 510280)



强直性脊柱炎患者髋关节滑膜组织中骨硬化蛋白、β-链蛋白表达观察

祁伟仲，李奇，林荔军，王宇召，陆遥

(南方医科大学珠江医院，广州 510280)

目的观察强直性脊柱炎(AS)患者髋关节滑膜组织中骨硬化蛋白(SOST)、β-链蛋白(β-catenin)表达变化，并探讨其意义。方法AS患者15例(观察组)，创伤性骨折患者18例(对照组)，分别采别用免疫组化法和Western blotting法检测两组髋关节滑膜组织中SOST、β-catenin。结果观察组SOST、β-catenin的IOD值分别为36.433±17.281、83.077±37.988，对照组分别为7.417±3.843、16.099±6.862，两组比较，P均<0.05；观察组SOST、β-catenin相对表达量分别为14.608±1.945、6.226±1.015，对照组分别为0.910±0.030、0.960±0.050，两组比较，P均<0.05。结论AS患者髋关节滑膜组织中SOST、β-catenin表达升高。

强直性脊柱炎；骨硬化蛋白；β-链蛋白；外周关节骨化

强直性脊柱炎(AS)是一种骨骼及软组织慢性进行性风湿性疾病，炎症不仅累及中轴关节，而且对全身多处关节均造成慢性炎症损伤，最终导致关节纤维化及骨性强直。β-链蛋白(β-catenin)是Wnt信号通路中的一个重要组成部分，它被Wnt蛋白激活后再参与下游基因的转录，骨硬化蛋白(SOST)是Wnt/β-catenin信号通路的抑制剂，SOST和β-catenin的变化在骨形成的平衡调节中发挥重要作用。本研究观察了AS患者髋关节滑膜组织中SOST、β-catenin的表达变化，以探讨AS外周关节异位骨化的机制，旨在寻找骨化依赖的信号通路和作用靶点。

1　资料与方法

1.1临床资料选取2011年5月～2014年5月南方医科大学珠江医院收治的AS患者15例(观察组)，男13例，女2例；年龄(37±11)岁；诊断符合1984修订的纽约诊断标准。另选18例创伤性骨折患者作对照(对照组)，男15例，女3例；年龄(52±4)岁；排除风湿病、髋关节滑膜炎等疾病。手术留取受试对象髋关节滑膜组织。

1.2滑膜标本制备所有标本均经0.9%生理盐水清洗3～5遍，洗净血液，分两份处理。第一份以10%中性甲醛固定24～48 h，常规脱水，石蜡包埋,做连续组织切片，厚度为4 μm,留作免疫组化检测使用。第二份在无菌操作下，切碎放入冻存管中，转入-196 ℃低温液氮中保存,留作Western blotting检测使用。

1.3滑膜组织SOST、β-catenin检测

1.3.1免疫组化SP法标本脱蜡和水化，抗原微波热修复15 min，PBS冲洗。滴加5%BSA封闭30 min，滴加Ⅰ抗(50倍稀释的SOST和β-catenin)，4 ℃过夜，PBS冲洗。滴加生物素化山羊抗兔IgG，37 ℃、30 min，PBS冲洗。滴加SABC，37 ℃、30 min，PBS冲洗。使用DAB显色试剂着色。蒸馏水洗后苏木素复染。脱水、透明、封片、镜检。结果使用Nikon 550i显微镜摄像系统观察及摄影。结果判定标准：SOST、β-catenin以细胞质或细胞核着色成棕黄色或者棕褐色为阳性。采用Image-pro plus6.0图像处理分析系统对免疫组化进行定量分析，所有切片放大倍数为400×。每张切片观察6个视野，结果以单个视野下平均光密度(IOD)来表示。

1.3.2Western blotting法充分研磨组织至匀浆。取蛋白样品，用BCA法对蛋白样品进行定量，取等量蛋白用10%SDS-PAGE进行电泳，恒压将蛋白转至PVDF膜。经5%脱脂奶粉封闭，稀释后加入一抗，4 ℃孵育过夜，加入荧光二抗，室温孵育2 h。α-tubulin作为内源性参照。结果判定标准：检测两组滑膜标本中SOST、β-catenin灰度值，分别与对应的α-tubulin蛋白灰度值比较，计算两者比值。

2　结果

观察组SOST、β-catenin的IOD值分别为36.433±17.281、83.077±37.988，对照组分别为7.417±3.843、16.099±6.862，两组比较，P均<0.05；观察组SOST、β-catenin的相对表达量分别为14.608±1.945、6.226±1.015，对照组分别为0.910±0.030、0.960±0.050，两组比较，P均<0.05。

3　讨论

AS是一种骨骼及软组织慢性进行性炎症性疾病，主要对脊柱、全身多处关节及邻近肌腱、韧带造成损伤。AS患者中，约有一半以上存在外周关节发病，其中髋关节受累的发生率较高[1]。AS关节发病早期即出现以滑膜病变为主的炎症改变[2]，接着骨侵蚀破坏，继而新骨形成、骨赘增生，最终发展为全关节骨化强直[3,4]。滑膜有炎症时，各种细胞因子诱导使局部滑膜组织血管化，聚集分化出多种潜能的前体干细胞，诱导滑膜细胞向骨性细胞分化。因此，滑膜是AS关节骨硬化和骨赘形成的特殊组织部位。正确处理AS骨化影响因素对患者诊断、预后及治疗皆具有重要指导意义[5]。

Wnt/β-catenin信号通路对骨形成的平衡调节发挥重要作用，激活通路后可促进骨硬化、骨赘的形成[6，7]，故Wnt信号通路被认为是调控AS异位成骨的关键途径之一，对细胞的生长和功能具有重要调节意义[8,9]。Wnt蛋白与细胞膜上的卷曲蛋白胞外区特异性结合，此过程需与低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6(LRP5/6)识别形成共受体[10]。卷曲蛋白变构激活后，促进β-catenin复合体解聚和抑制β-catenin单体降解，使胞内β-catenin积聚到一定浓度后进入胞核，后与细胞因子作用，进行下游基因转录[11]。Wnt信号通路的启动蛋白是一类具有相同半胱氮酸残基的分泌型糖蛋白[12,13],而作为Wnt信号抑制剂的SOST可与LRP5/6受体竞争性结合[14，15]，抑制信号通路转导。在对Wnt诱导蛋白聚合和齐聚的研究[16]中发现，介导LRP6受体可影响或增强Wnt信号的活性[17]。以上说明SOST和Wnt信号通路联系紧密，或可通过LRP受体影响Wnt信号通路。研究[18,19]发现，与正常人相比，AS患者骨硬化蛋白低水平表达与骨赘形成存在相关性，血清水平降低的患者更易发生关节强直。Klingber等[20]发现，AS患者血清SOST水平明显低于健康组。研究[21]报道，血清中SOST持续低水平可能是AS患者抗炎治疗的结果。因此，Wnt信号抑制剂水平或成为预测AS患者骨化能力的指标之一[22,23]，而其抑制剂水平或成为预测AS患者骨化能力的指标之一[24]。

本研究发现，观察组SOST、β-catenin表达较对照组升高。Wnt通路活化时，局部组织内β-catenin表达量将增加，此结论与实验结果相符合。而作为抑制剂的SOST，在局部滑膜组织中的表达却明显增高，此发现在国内外暂未见相关报道。考虑其增高的原因如下：①SOST通过负反馈机制抑制调节信号通路作用。在Wnt信号转导途径激活的同时，其受体相关蛋白LRP5/6增多。而协受体的增多也需要相应的抑制剂去中和。因此，当出现LRP受体蛋白增加的情况，作为负性调控的抑制剂SOST出现反应性增高。②不同部位所表达的蛋白效应与浓度不同。在国内外研究中，主要以检测AS患者血清SOST水平，血清中的浓度与全身骨细胞释放入血的蛋白水平有关。而我们此次实验选择的是关节腔内滑膜组织。因解剖学关系，骨化关节的滑膜组织所代表的是局部成骨能力的体现。在成骨能力较强的组织中，作为抑制剂的SOST，其表达同样可高于其他部位。通过免疫组化染色镜下观察发现，SOST和β-catenin主要分布于滑膜组织中的成纤维细胞胞质中。van Bezooijen等[25]认为，SOST在人体由骨细胞特异性分泌;但最近研究[26]在骨组织及软骨组织中也发现其存在。因此，SOST的产生来源或许是其骨化的始动靶点。有学者实验发现，成纤维细胞是AS韧带骨化的发生细胞[27]，AS关节囊中成纤维细胞也处于过度增殖状态[28]。在对AS骶髂关节炎研究中发现[29]，骨和软骨的破坏与成纤维细胞的增殖情况密切相关，随着成纤维细胞增殖程度改变，局部炎症也由侵袭破坏逐渐转向新骨形成[30]。以此推测，成纤维样滑膜细胞作为AS髋关节滑膜组织骨化作用的主要发生细胞可能向成骨细胞分化。

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国家自然科学基金资助项目(81430031)。

李奇(E-mail： qili565@foxmail.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.15.033

R593.23

B

1002-266X(2016)15-0086-03

2015-11-06)